华南地区致病性猪大肠杆菌的鉴定和血清型分布

王文豪，苏丹萍，张丹琳，申翰钦，张显浩，陈瑞爱，，贺东生，

（1．华南农业大学兽医学院，广东 广州510642；2．广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室，广东 肇庆526238）

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的猪肠道传染性疾病，其主要危害1月龄以内的仔猪。根据发病日龄及临床症状可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿3种。该病的发病率与死亡率均很高，给我国的养猪业带来极大的危害。由于大肠杆菌的血清型众多且各疫苗之间交叉免疫保护力低下，预防该病时一定要选择适合当地流行的优势菌株制备的疫苗进行免疫接种，才能起到事半功倍的效果。为了解华南地区猪大肠杆菌病流行情况及其优势血清型的分布情况，以便为该病的防控提供理论依据，我们进行了此项观察，报告如下。

1 材料与方法

1．1 病料 分别来自广东、广西、江西、湖南、福建、海南7个地区的38家猪场病猪的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结等组织。

1．2 主要试剂和培养基 营养肉汤、营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝平板，均购自北京普博欣生物科技有限责任公司；药敏纸片及生化试剂，购自杭州天和微生物试剂有限公司；47种大肠杆菌标准O抗原单价血清，购自中国兽医药品监察所；昆明系SPF小鼠，购自广州中医药大学。

1．3 大肠杆菌的分离培养 用接种环无菌采取病料于麦康凯平板上划线培养，37℃培养18～24h，挑取单个粉红色菌落于伊红美蓝培养基上，37℃培养24h，取伊红美蓝上具有金属光泽的单个菌落涂片染色镜检。

1．4 生化试验 按常规方法对分离的74株细菌进行葡萄糖、麦芽糖、硝酸盐、乳糖、靛基质、M．R、蔗糖、明胶、V－P等12项生化指标测定［1］，观察并记录试验结果。

1．5 大肠杆菌血清型鉴定 挑取经分离培养、形态特点、生化鉴定为大肠杆菌的单菌落，接种到肉汤培养基中，37℃培养18h。把菌液转移至5mL的离心管中，5 000r／min离心10min；去上清，沉淀用4 mL生理盐水振荡混匀，5 000r／min离心10min；重复洗涤3次后去上清，沉淀用1．5mL生理盐水振荡混匀，制成浓稠菌悬液，121℃高压2h，破坏细菌K抗原［2］。待菌悬液冷却后，取25μL抗原与25μL稀释的血清与洁净的玻璃板上混匀，如1～3 min内出现明显凝集现象可判定为阳性，同时用无菌生理盐水与血清混合作对照，观察细菌有无自凝现象［3］。

1．6 小鼠致病性试验 从优势血清型中选取18株大肠杆菌分别接种普通肉汤，37℃培养18h。稀释细菌到109CFU／mL后经腹腔注射小鼠，每株菌注射4只，每只0．2mL；另4只作为阴性对照，腹腔注射0．2mL新鲜肉汤，观察小鼠的发病死亡情况并对死亡小鼠剖检观察，无菌采取死亡鼠的肝脏组织接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养18～24h后对分离到的细菌重新鉴定。判断标准：致死4只或3只小鼠的为强毒株；2只的为中毒株；1只的为低毒株；不致死的为无毒株［4］。

2 结果

2．1 细菌的分离培养 从病料中分离到的74株细菌在麦康凯培养基上呈粉红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑湿润。在伊红美蓝平板上长出有金属光泽的紫色菌落。这些菌落经革兰染色后在显微镜下均为两端钝圆的革兰阴性菌。

2．2 生化试验 74株分离菌经生化试验结果均符合大肠杆菌的生化鉴定特征，见表1。

2．3 O抗原血清型鉴定 由玻板凝集试验可知，74株大肠杆菌分离菌中的66株分属于14个血清型，优势血清型为 O107、O101、O9、O60、O26，占分离株的70．3%，另有8株未定型，占分离株的10．8%。见表2。

2．4 毒力试验 从优势血清型 O107、O101、O9、O60、O26中选出18株代表菌株进行小鼠毒力试验发现，18株菌株中有7株强毒株，7株中等毒力株，2株低毒株，2株无毒株。见表3。

表1 分离菌株的生化鉴定

表2 华南地区大肠杆菌分离株血清型鉴定

表3 优势血清型菌株的毒力试验

3 讨论

本文对华南地区大猪场，尤其是发病猪内脏器官（菌血症）的致病性大肠杆菌的血清型进行分离和鉴定。在鉴定过程中，发现有些菌株的O抗原能够与多个单因子血清进行凝集反应，这和黄炯［5］、陶勇［6］报道的一致。在凝集试验中我们还发现，来源不同的菌株在出现与多个单因子血清都有凝集反应时，每次出现凝集反应的那几个单因子血清种类基本上是相同的。此外，需要注意的是，当有单因子血清O101与O107、O117等血清同时与某一菌株反应时，O101血清的凝集反应现象总是最为明显。同时在O101没有出现凝集反应，而O107与O117、O131等其他血清同时与某一菌株反应时，O107的反应程度通常是最大的。推测发生这种现象的菌株可能存在多种表面抗原，且这些表面抗原具有某种共同的特性。目前对于大肠杆菌的分型主要是通过血清型鉴定来实现的，能否在血清型鉴定的基础上站在共性抗原这个角度对大肠杆菌进行进一步分类值得考虑。

猪场中致病性大肠杆菌的优势血清型在不同地区和不同时间会有改变。各血清型之间不但具有区域差异性，而且就算是在同一地区随着时间的变化血清型也会随之变化。高云英等在2005年曾报道，陕西省猪大肠杆菌流行的优势血清型为O139、O101、O149、O141、O60［7］。陈祥等于2008年对华东地区部分猪场血清型鉴定后发现，O149、O107、O139、O93和O91是该地区流行的优势血清型［8］。不仅如此，1998年，姜卫东等曾报道，O119、O60、O75、O141、O20、O8和O101为广东省猪大肠杆菌流行的优势血清型［9］。10余年后，2010年苏丹萍等再次对广东地区猪大肠杆菌分离鉴定后，发现血清型O138、O9为该地区流行的优势血清型［10］。而这些都与华南地区猪大肠杆菌优势血清型 O107、O101、O9、O60、O26有一定的差别。在本试验定型的66株大肠杆菌中有14种血清型，另有8株未定型，这8株菌株是否属于47种主要血清型之外或是新流行的其他血清型尚待进一步研究。在华南地区各省份各猪场之间大肠杆菌血清型分布差异也较大，甚至同一猪场也有几种血清型菌株同时存在，因此必须定期对猪场的大肠杆菌进行血清型鉴定，从而研制血清型针对性强的疫苗才是防控该病的关键。本试验从定型的菌株中选出5种18株优势血清型菌株进行毒力试验，毒力试验结果表明，在5种优势菌株中均可以找到较强毒力的菌株。本试验对近年来华南地区猪致病性大肠杆菌的优势血清型做了系统调查，为以后大肠杆菌疫苗研制和疫病防控奠定了基础。

［1］ 陆承平．兽医微生物学［M］．3版．北京：中国农业出版社，2001：215－223．

［2］ 闫祖书，魏拣选，张彦明，等．陕西省部分地区仔猪水肿病病原的分离鉴定［J］．动物医学进展，2005，26（7）：79－81．

［3］ 张晓东．一例鸡大肠杆菌的分离与鉴定［J］．中国家禽，2011，33（17）：55．

［4］ 王红琳，熊忠良，周绍凤，等．湖北省仔猪致病性大肠杆菌血清型鉴定［J］．动物医学进展，2002，23（3）：68－69．

［5］ 黄炯，黄丽茜，卓菲娅，等．鸡致病性埃希氏大肠杆菌不同菌株间同源性抗原的研究［J］．中国畜禽传染病，1998，20（3）：163－164．

［6］ 陶勇．四川鸡源致病性大肠杆菌血清型鉴定及质粒DNA分析［D］．雅安：四川农业大学，2001．

［7］ 高云英，李浩波，李琳，等．陕西仔猪致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性测定［J］．中国农学通报，2005，21（9）：12－15．

［8］ 陈祥，赵李祥，高崧，等．猪源大肠杆菌（ETEC、STEC、AEEC）毒力基因及其与O抗原型的关系［J］．微生物学报，2008，48（7）：857－862．

［9］ 姜卫东，黄引贤．广东省仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定［J］．中国兽医学报，1998，18（1）：64－66．

［10］苏丹萍，赵彦宗，陈敏鸿，等．广东地区部分猪场大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］．畜牧与兽医，2010，42（7）：80－82．