单核细胞趋化蛋白-1在内源性神经干细胞迁移中的作用①

丁鹏，周长胜，戴孝森，陆斌，王崇谦，王伟民，王进昆

20世纪90年代初，Reynolds和Richards等先后从成年鼠的纹状体和海马中分离出神经干细胞(neural stem cells,NSCs)[1-2]，打破了成体哺乳动物神经细胞不能再生的传统观念。NSC除在特定的胚胎发育期存在外，在成年哺乳动物大脑中也分布广泛，其中侧脑室壁的脑室下区和海马齿状回的颗粒下区是NSCs分布的两个主要区域[3]。研究表明，中枢神经系统发生病理改变后，NSCs会特异性地向损伤部位迁移，并可替代缺失的细胞，从而恢复受损脑组织结构和功能[4-8]。我们先前通过体外实验证实，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)体外可趋化神经干细胞迁移，其趋化迁移作用与浓度正相关。本实验探讨MCP-1在体对NSCs迁移的趋化作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，鼠龄4～5个月，体重(300±25)g，购于昆明医学院实验动物中心。实验过程对动物的处理符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导意见》的规定[9]。

1.2 试剂与仪器

兔抗大鼠nestin多克隆抗体、兔抗大鼠MCP-1多克隆抗体、兔SP Kit、DAB Kit、HE染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；革兰氏阴性菌胞壁脂多糖(LPS)购自SIGMA公司；大鼠脑立体定向仪购自中西远大科技有限公司。

1.3 模型制备

参照文献脑皮质微量注射内毒素建立脑损伤模型[10]。分为：①对照组：颅内注射生理盐水5µl；②实验组：颅内注射脂多糖5µl(脂多糖5µg溶于生理盐水5µl)。两组均再分为3 d、5 d、7 d组，每组6只。实验过程死亡者，按相同数量补充。

1.4 标本采集与处理

按文献方法于造模后3 d、5 d、7 d取材[10]。3%H2O2去离子水(无色液体)孵育8 min，PBS冲洗5次，每次3 min；滴加山羊血清工作液室温孵育10 min，倾去；滴加1∶100一抗(兔抗大鼠nestin多克隆抗体、兔抗大鼠MCP-1多克隆抗体、兔SP Kit)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗5次，每次5 min；滴加生物素标记二抗工作液，37℃孵育15 min。PBS冲洗5次，每次5 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS冲洗5次，每次5 min；显色剂显色(DAB)，自来水充分冲洗，苏木素复染，常规脱水，透明，封片。

切片高倍镜下采用图像分析软件ImagePro-Plus 6.0分析，记录累积吸光度值(IA值)表示，免疫反应产物的IA值减去背景的IA值，得到矫正IA值(CIA值)即免疫反应产物的实际累积吸光度值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 MCP-1

MCP-1阳性产物为棕黄色点状或颗粒状沉积，主要分布细胞胞质中。各时间点对照组MCP-1在皮质、海马、脑干部位均有少量表达。实验组造模后3 d时，MCP-1除了在上述部位表达外，主要在损伤边缘表达；造模后5 d表达到峰值，范围扩大至损伤周围；造模后7 d表达量和范围较前减少(图1)。

对照组各时间点MCP-1 CIA值无显著性差异(P＞0.05)。实验组MCP-1各时间点CIA值均显著高于对照组(P＜0.001)。见表1。

表1 各组MCP-1表达(CIA值)

图1 各组MCP-1表达(免疫组化染色，200×)

2.2 nestin

nestin阳性产物为棕黄色点状或颗粒状沉积，主要在细胞内。各时间点对照组大鼠nestin阳性细胞在海马区表达，量较少。实验组造模后3 d见中等量nestin阳性细胞在海马区表达；5 d海马区大量表达，并向损伤区迁移；7 d损伤区可见nestin阳性细胞(图2)。

对照组各时间点nestin CIA值无显著性差异(P＞0.05)。实验组各时间点均显著高于对照组(P＜0.001)。见表2。

表2 各组nestin表达(CIA值)

图2 实验组nestin表达(免疫组化染色)

3 讨论

在脑损伤、癫痫、神经细胞变性等[4-8]时，NSCs可被激活，发生增殖、迁移和分化，恢复神经系统的正常结构和功能。目前调控NSCs增殖和迁移的机制还不完全清楚，可能与以下因素有关[11-15]：细胞周围环境、细胞代谢产物、细胞因子、黏附分子、激素和递质等。

有学者认为以MCP-1为代表的趋化因子可能发挥着重要作用[16]。MCP-1属于CC类趋化因子，由Yoshimura于1989年首次从神经胶质瘤系U-105MG分离纯化得到[17]，是一种具有多种生物学功能的趋化因子。它通过与表面受体CCR2结合，激活细胞内信号转导通路，引起与细胞迁移或激活相关的一系列细胞内变化[18-19]。脑内MCP-1主要在星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元表达。正常脑组织MCP-1维持在较低水平，当受到损伤时，表达水平上调。

Yamagami等的研究显示，在小鼠局灶性脑缺血模型中，缺血区皮质和基底节MCP-1表达上调，脑室下区的NSCs向缺血区定向迁移[20]。Belmadani等的研究显示，敲除小鼠MCP-1或CCR2基因后，NSCs向损伤区的迁移显著减少[21]。本课题组先前证实，MCP-1在体外可趋化神经干细胞迁移，其趋化作用与浓度成正相关，并发现NSCs表达趋化因子MCP-1的特异性受体CCR2[22]。以上研究提示，MCP-1-CCR2轴可能参与了神经修复的过程。但是其在体内促进NSCs的增殖与迁移的机制尚不清楚。

本实验通过制备脑皮质微量注射脂多糖脑损伤模型，应用冰冻切片免疫组织化学染色法，动态监测MCP-1和nestin阳性细胞的时相变化。发现损伤后，MCP-1表达的量和范围增加，5 d时达到高峰；同时观察到海马区nestin阳性细胞增殖，7 d时损伤区可见nestin阳性细胞。考虑可能是趋化因子MCP-1的升高趋化表达其特异性受体的NSCs向损伤区迁移，即在脑皮质微量注射脂多糖脑损伤模型中，MCP-1有一过性增加，而升高的MCP-1对NSCs从海马区向损伤区迁移可能具有正性诱导作用。

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[9]中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见[S].2006-09-30.

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