NF-κB p65在去卵巢大鼠骨丢失中的作用

郭 影 郭 丽 张陈彦 狄建敏 (河北医科大学第三医院，河北 石家庄 05005)

骨保护蛋白(OPG)/RANKL/核因子 κB受体活化因子(RANK)系统是近年来发现的在破骨细胞分化过程中的一个重要信号传导通路，作为雌激素发挥抗骨吸收作用的中间环节，提出成骨细胞调控破骨细胞分化成熟的机制，在绝经后骨质疏松(PMOP)发病中发挥重要作用，其中核转录因子(NF)-κB通路调节破骨细胞发育和蛋白酶合成。NF-κB是诱导破骨细胞产生中最重要的转录因子之一，抑制该因子或抑制其介导的信号通路中其他细胞因子的表达可减少甚至抑制破骨细胞的生成。本研究以去卵巢大鼠建立PMOP模型，观察各组大鼠体重、股骨骨密度(BMD)及骨组织学变化，检测各组大鼠骨组织中NF-κB p65，研究NF-κB表达异常与PMOP发生的关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组和PMOP动物模型制备 3月龄成年雌性Sprague/Dawley大鼠30只，随机分为两组，每组15只:①假手术(Sham)组、②卵巢切除(OVX)组。将大鼠以10%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌条件下，经腰背部正中纵形切口进入腹腔背侧，将OVX组大鼠切除双侧卵巢，Sham组大鼠切除双侧卵巢下方少许脂肪组织，重量约与卵巢相同。术后正常摄食水，实验共12 w。

1.2 双能X线吸收法确立PMOP动物模型 于去势后12 w，分别取各组大鼠置于Osteocore3型双能X线骨密仪上，通过计算机系统中心动物软件，测量每只大鼠双侧股骨及腰椎BMD，取平均值。BMD值用g/cm2表示。

1.3 苏木素-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色 动物处死后，立即无菌操作取左侧股骨下段，进行HE染色、免疫组织化学染色及观察。

1.4 结果判定与图像分析、统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，所测数值均以±s表示，方差齐性检验采用Levene法，各组间变量比较采用完全随机的单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠股骨BMD比较 与Sham组〔(0.209±0.010 5)g/cm2〕相比，OVX组 BMD明显下降〔(0.181±0.008 5)g/cm2〕(P＜0.05)。

2.2 骨组织学观察 与Sham组大鼠比较，OVX组大鼠骨皮质变薄，骨小梁稀疏或断裂，骨髓腔增宽。见图1。

图1 两组骨组织学观察(HE)

2.3 免疫组织化学染色观察及结果 NF-κB p65主要位于骨小梁周边成骨细胞、骨细胞中，骨髓基质细胞亦呈阳性染色。OVX组骨小梁周边NF-κB p65阳性细胞数明显多于Sham组，且表达强于Sham组。见图2。

与Sham组(105.59±4.938)相比，OVX组大鼠骨组织中NF-κB p65阳性细胞染色灰度值(150.506±5.510)增高(P＜0.05)。

图2 免疫组织化学染色观察两组骨组织NF-κB p65 阳性细胞(DAB)

2.4 相关性分析 与Sham组相比，OVX组NF-κB p65表达与BMD呈负相关(r=-0.765，P＜0.05)。

3 讨论

切除双侧卵巢是复制PMOP模型的经典方法，3～9月龄为复制该模型大鼠的合适鼠龄〔1〕。本研究中选取3月龄成年雌性S/D大鼠为研究对象，BMD测定及组织学观察显示，OVX组大鼠较Sham组相比，BMD明显下降，骨皮质变薄，骨髓腔扩大，骨小梁稀疏或断裂，骨小梁宽度变窄、间距变宽，表明PMOP模型建立。

骨组织中NF-κB家族是控制破骨细胞生成和激活的重要因子，主要位于成骨细胞，骨细胞及骨髓基质细胞中。动物研究表明NF-κB p50/p52基因敲除的小鼠，表现为骨骼石化症〔2〕。其原因可能是在RANKL及其他破骨细胞刺激因子作用下，RANK刺激破骨细胞前体细胞分化为抗酒石酸性磷酸酯酶阳性(TRAP+)破骨细胞的途径中，NF-κB介导的细胞内信号转导通路受阻造成〔3〕。

研究表明雌激素可能通过以下几种途径抑制NF-κB的表达:(1)雌激素可通过阻断IκB激酶(IKK)的活化，减少IκB的降解，从而抑制 NF-κB 的活化〔4〕;(2)雌激素受体与 NF-κB 之间有相互拮抗作用，雌激素可以通过上调受体途径抑制NF-κB的活化〔5〕;(3)雌激素通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，进而抑制细胞因子诱导的NF-κB活化〔6〕。PMOP中由于雌激素的减少，使之对NF-κB的抑制作用减低，NF-κB在骨组织中表达异常增加，导致受其调节的靶基因表达异常增多，如破骨细胞刺激因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)及TNF-α等，最终造成绝经后的骨丢失。

本试验与上述研究结果一致，结果显示:(1)免疫组织化学观察，NF-κB p65阳性信号主要位于骨小梁周边成骨细胞、骨细胞及骨髓基质细胞中，OVX组骨小梁周边阳性细胞数明显多于Sham组。(2)骨组织中NF-κB p65阳性细胞染色灰度值测定结果，OVX组骨组织中NF-κB p65明显高于Sham组。(3)NF-κB p65与BMD相关性分析结果显示，与Sham组相比，OVX组NF-κB p65表达与BMD呈负相关。可见，伴随NF-κB p65在两组大鼠骨组织中表达增高，BMD有下降的趋势，而且在OVX组中NF-κB p65表达与BMD呈负相关，表明NF-κB在PMOP的发病机制中可能起到重要作用。

1 Shiraishi A，Takeda S，Masaki T，et al.Alfacalcidol inhibits bone resorption and stimulates formation in an ovariectomized rat model of osteoporosis:distinct actions from estrogen〔J〕.J Bone Miner Res，2000;15(4):770-9.

2 Iotsova V，Caamano J，Loy J，et al.Osteopetrosis in mice lacking NF-κB1 and NF-κB2〔J〕.Nat Med，1997;3(11):1285-9.

3 Soysa NS，Alles N.NF-kappa B functions in osteoclasts〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2009;378(1):1-5.

4 Sun WH，Keller ET，Stebler BS，et al.Estrogen inhibits phorbol ester-induced I kappa B alpha transcription and protein degradation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;244(3):691-5.

5 Mckay LI，Cidlowski JA.Cross-talk between nuclear factor-kappa B and the steroid hormone receptors:mechanisms of mutual antagonism〔J〕.Mol Endocrinol，1998;12(1):45-6.

6 Yamaguchi M，Weitzmann MN.The estrogen 17 beta-estradiol and phytoestrogen genistein mediate differential effects on osteoblastic NF-kappaB activity〔J〕.Int J Mol Med，2009;23(2):297-30.