氯沙坦对Thy1肾炎大鼠肾小球系膜细胞CDK2表达的影响

秦福芳 孙 倩 邵凤民 阎 磊 (郑州人民医院特需科，河南 郑州 450003)

肾小球系膜细胞增生是多种肾小球疾病的病理改变，也是肾小球硬化的重要病理基础〔1〕。人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)作为一种细胞周期正控蛋白，在细胞周期G1和S期过程中有重要的作用〔2〕。血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)受体拮抗剂 (ARB)氯沙坦在受体水平阻断AngⅡ的作用，而该药物对肾脏的保护作用日益受到关注〔3，4〕。本实验主要观察氯沙坦对T细胞分化抗原1(Thy1)肾炎大鼠系膜细胞CDK2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 挑选108只Wistar雄性大鼠，体重160～200 g，采用随机方式把大鼠分成三组:(1)对照组;(2)Thy1肾炎组，尾静脉注射兔抗大鼠胸腺细胞血清(0.5 ml/kg);(3)服用氯沙坦的Thy1肾炎组，尾静脉注射抗血清后立即给予缬沙坦溶液(500 mg/L)每组36只。以1、3、5、7 d为标准把三组分别设为4个时间点，每个时间点9只。

1.2 观察指标及方法 (1)肾脏病理:采用4 μm的石蜡切片(HE、PAS、PASM)并用透射电镜检查。计数肾小球有核细胞(PAS染色切片)，计算系膜区占肾小球面积百分比(PASM染色切片，点计数法)。取20个皮质区的肾小球，计数并计算其平均值。(2)免疫组化:用升汞-苦味酸混合固定液固定肾组织标本，随后用石蜡包埋、切片，保持切片的厚度为4 μm。链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法检测肾小球CDK2和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况，并对结果进行半定量分析(CMIAS医学图像分析系统)。(3)首先分离肾小球，并提取其总蛋白，最后用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量。采用Western印迹分析肾小球CDK2的表达情况蛋白含量用平均光密度的OD值和其面积的乘积表示。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0软件分析数据，计数资料比较采用χ2检验;计量资料用±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 肾脏病理学研究 注射兔抗大鼠胸腺细胞血清(ATS)，1 d后观察，发现肾小球内部出现了系膜溶解和炎细胞浸润现象，系膜细胞的数量明显减少，在少数肾小球内部，毛细血管发生扩张，最终形成微动脉瘤。ATS注射3～7 d后观察，发现系膜溶解征逐渐消退，系膜细胞增生，并且在肾小球内部，有核细胞数量不断增多，积聚了大量的系膜基质。3～7 d后与Thy 1肾炎组相比，氯沙坦肾炎组的系膜细胞增生和系膜扩张程度较轻，并且缩短了系膜的修复时间。见表1。

2.2 免疫组化结果 对照组肾小球PCNA的表达量极少，几乎没有表达CDK2。对比而言，在Thy1组和氯沙坦肾炎组的肾小球内部，PCNA和CDK2表达有逐渐增高的趋势。在5～7 d时达到最高量。在第3、5、7天时间点，氯沙坦肾炎组PCNA和CDK2表达低于Thy1组(P＜0.05)。见表2。

2.3 Western印迹分析 对照组内CDK2表达量最低，并且在肾小球内系膜细胞增生时其表达量增加，第5天时达最大值。氯沙坦肾炎组的CDK2比对照组高，并会随增生而表达量增加表达量，在第5天时最高。氯沙坦肾炎组的表达量明显低于Thy1组(P＜0.05)。见表2，图1。

表1 肾小球有核细胞计数及系膜区面积/肾小球面积的百分比(±s)

表1 肾小球有核细胞计数及系膜区面积/肾小球面积的百分比(±s)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与氯沙坦肾炎组比较:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

组别 肾小球有核细胞数/肾小球系膜区面积/肾小球面积(%)56.1±9.6 11.43±1.08第3天 56.2±9.5 11.42±1.06第5天 56.3±9.7 11.43±1.07第7天 56.1±9.6 11.43±1.09 Thy1组 第1天 44.1±5.3 9.02±1.80第3天 61.9±7.9 19.0±4.122)第5天 81.5±5.22) 23.88±1.002)第7天 78.9±6.52) 27.01±3.992)氯沙坦肾炎组 第1天 46.1±6.4 9.43±2.01第3天 49.3±7.03) 13.89±1.411)3)第5天 71.1±6.51)4) 17.00±1.922)3)第7天 68.8±8.21)3) 18.99±5.012)4)对照组 第1天

表2 各组肾小球系膜细胞PCNA、CDK2的表达(±s)

表2 各组肾小球系膜细胞PCNA、CDK2的表达(±s)

组别 PCNA CDK2 CDK2 Western印迹分析0.40±0.11 7.98±0.88 0.19±0.05第3天 0.41±0.12 7.99±0.83 0.20±0.06第5天 0.43±0.11 7.98±0.87 0.17±0.05第7天 0.40±0.10 8.01±0.89 0.19±0.04 Thy1组 第1天 1.01±0.142) 4.03±0.532) 1.41±0.232)第3天 4.68±1.012) 3.42±0.382) 3.42±0.062)第5天 10.99±1.982) 3.65±0.562) 4.75±0.322)第7天 9.12±1.542) 5.96±0.992) 3.99±0.022)氯沙坦肾炎组 第1天 1.05±0.312) 4.32±0.662) 1.06±0.082)4)第3天3.52±0.332)3)4.98±0.452)4) 2.38±0.032)4)第5天8.01±0.432)3)4.73±0.542)3) 3.04±0.152)4)第7天7.18±0.992)3) 7.22±0.163) 2.73±0.171)3)对照组 第1天

3 讨论

很多肾小球疾病会表现为肾小球系膜细胞增殖，因此，研究肾小球系膜细胞增生的机制，并最终阻止其发展有着非常重要的意义。细胞增殖的基础是细胞周期，各种促增殖因子对细胞的影响作用最后会反映在细胞周期上。细胞周期调控蛋白会控制细胞周期的正常进行，其中一个重要的细胞周期调控蛋白是 CDK2〔5〕。

图1 Western印迹分析CDK2表达变化

CDK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在G1期能与细胞周期素E结合，而在S期则和周期素A结合，进而形成周期素，即CDK2复合物，这种周期素具有全酶活性，能有效促进细胞周期的顺利进行。用血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的体外试验，促使系膜细胞增生，CDK2蛋白水平会明显升高〔6〕。在本试验中，正常大鼠肾小球静止期系膜细胞的CDK2表达水平极低。相反，抗Thy6系膜增殖性肾炎模型中CDK2在肾小球系膜细胞增殖时有明显上调的趋势。CDK2表达水平随细胞增生程度的提高而提高。当大鼠处于病理状态下时，CDK2的表达水平与系膜细胞增生具有显著相关性。因此，CDK2作为作用靶点很可能对系膜增殖性肾炎的治疗有重要的意义。Dousa等指出，为有效降低CDK2的表达，抑制因子Olomousine很可能发挥重要的作用。病理状态下，肾组织局部的AngⅡ浓度可达到血浆AngⅡ1 000倍左右，能促进肾小球疾病的发生，可见，阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)能防治肾脏疾病〔7，8〕。

本试验发现，氯沙坦能明显减轻肾炎大鼠的系膜细胞增生及系膜扩张程度，CDK2表达降低。说明氯沙坦在一定程度内能抑制肾小球系膜细胞CDK2的表达，氯沙坦的作用机制与其抑制系膜细胞CDK2表达相关。该研究为氯沙坦的应用提供了重要的理论依据。

1 马祖祥，何小解，赵维玲，等.pRb的磷酸化状态在肾小球系膜细胞增生和凋亡中的作用〔J〕.中国中西医结合肾病杂志，2010;11(9):774-6.

2 余荣杰，杨惠标，赵景宏，等.缬沙坦对Thy1肾炎大鼠肾小球系膜细胞CDK2表达的影响〔J〕.中国中西医结合肾病杂志，2007;8(2):81-3.

3 Wolf G.Angiotensin II as a renal growth factor〔J〕.Contrib Nephrol，2011;135(11):92-110.

4 Wolf G，Wenzel UO.Angiotensin II and cell cycle regulation〔J〕.Hypertension，2004;43(4):693-8.

5 De Wolf WC，Gaston SM.The cell cycle and its relevance to the urologist〔J〕.Urol，2004;171(4):1674-81.

6 Shankland SJ，Douahji M.Cell cycle regulatory proteins in glomerular disease〔J〕.Exp Nephrol，2009;7(3):207-11.

7 Cantarovich F，Rangoonwala B.Therapeutic effects of angiotensin Ⅱinhibition or blockade on the progression of chronic renal disease〔J〕.Int J Clin Prac，2003;57(9):801-22.

8 朱诗平，孙升云，冯伟峰.氯沙坦对肾间质纤维化大鼠肾组织ACE2mRNA、TGF-β1mRNA 表达的影响〔J〕. 中国老年学杂志，2012;32(5):968-71.