三氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

李海燕 曹励民 王 娟 (西安医学院医学技术系，陕西 西安 7002)

临床资料显示，约60%以上的肝癌(含早期肝癌)确诊时已发生临床或显微镜下转移〔1〕。因此抗侵袭转移，减少术后复发成为目前研究的热点和难点。三氧化二砷(As2O3)是砒霜的主要成分，已成功应用于急性早幼粒白血病(APL)的临床治疗，也已用于治疗胃癌、头颈 部癌和食管癌等实验研究〔2，3〕。新近研究发现，AS2O3有可能抑制肿瘤的转移。本文对其体外抑制肿瘤转移相关生物学行为的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 As2O3(哈尔滨伊达药业有限公司)，临用前用1640培养基稀释至所需要浓度。RPMI 1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，Transwell小室(3428型)(Coming公司)，Matrigel(5 g/L)(BD 公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，Fluorophore Sybr Green(Netherlands公司)。BCA蛋白定量检测试剂盒(美国Pierce公司)，ECL发光检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，MMP-9、α-tublin一抗(美国 ABCAM 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721，引自中国科学院上海细胞生物研究所，用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱单层传代培养。每2～3 d换液1次。待细胞生长至80%融合时传代进行实验。

1.2.2 细胞增殖实验 收集处于对数期生长的肿瘤细胞，调整细胞悬液密度，接种于96孔板，每孔200 μl，5 000个细胞/孔，孵育24 h使细胞贴壁。细胞贴壁后弃上清，更换新鲜的培养液，180 μl/孔并加入20 μl的各浓度药液，含 As2O3分别为1，2，4 μmol/L，空白对照仅加入 20 μl培养基，每组 6 个复孔，置摇床上低速振荡混匀，培养箱继续培养24 h后加入20 μl/孔MTS/PMS溶液，MTS的终质量浓度为333 μg/ml，PMS的终浓度为25 μmol/L，继续培养4 h，然后置摇床上低速振荡10 min，测量各孔在490 nm处的吸光值。

1.2.3 划痕愈合法测定细胞迁移能力试验 将2×106个SMMC-7721细胞接种在6孔板，培养至90%融合状态，无血清培养基饥饿24 h;用10 μl移液器的枪头沿培养板底部做“十”字划痕，划痕时要以直尺定位，尽量使划痕垂直于之前所做的定位横线。无血清培养液基洗3次，换新鲜无血清培养基，加入As2O3调节浓度为2.0 μmol/L。37℃，5%CO2培养箱中分别培养12 h，24 h后，倒置显微镜观察并拍照，使用Image J软件统计。对照组与实验组均设3个平行样本。

1.2.4 Transwell小室测定细胞侵袭能力 将Transwell放入24孔板内，Matrigel与无血清培养基1∶9配制，Transwell上层铺50 μl稀释的Matrigel，37℃过夜至 Matrigel胶凝固，种植细胞，每孔细胞数量为1×105个，无血清培养基300 μl，加入As2O3，调节药物浓度为2.0 μmol/L，置于细胞培养箱孵育。在12 h，24 h分别取出小室，以PBS清洗3次，用棉签小心刮除滤膜上面的细胞，膜下面细胞用甲醛固定，1%结晶紫染色15 min，PBS洗3次。倒置显微镜下观察并拍照，Image J软件计数细胞。

1.2.5 实时定量PCR 以2.0 μmol/L As2O3处理细胞，在各时间点以Total RNA Kit提取细胞总RNA，按试剂盒要求，逆转录合成cDNA。α-tublin，MMP-9基因引物及内参GAPDH基因引物设计及反应参数参考相关文献〔4，5〕，引物经上海生物工程有限公司鉴定其合理性后生成。MMP-9正义链:TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA，反 义 链:CGCCACGAGGAACAAACTGTAT;GAPD正义链:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反义链:TGGTGAAGACGCCAGTGGA。使用仪器CFD3120 MiniOpticon Detector(BIO-RAD，California，USA)进行实时定量 PCR，按照仪器使用说明书及其软件进行相应的设置。每个循环末自动记录荧光强度，结果应用GraphPad.Prism.v5.0.软件进行数据分析，相对表达量采用2-△△Ct方法计算〔6〕。

1.2.6 Western印迹 以2.0 μmol/L As2O3处理细胞，在各时间点分别收集细胞，PBS洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解提细胞总蛋白。蛋白质定量变性后上样，SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，半干转膜90 min。将转有蛋白条带的膜常规封闭、洗膜后分别与特异性一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗室温孵育1 h，孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹。薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0统计学软件进行结果处理，数据采用±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 As2O3对人肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的影响 未处理组与1、2和4 μmol/L AS2O3组SMMC-7721细胞增殖率分别为96%、80%、62%及31%;与未处理组比较，2和 4 μmol/L AS2O3组SMMC-7721细胞的增殖率明显降低(P＜0.01)。

2.2 As2O3对人肝癌SMMC-7721细胞迁移能力的影响 图1所示，未处理的SMMC-7721在12 h，24 h，细胞划痕距离较0 h明显减少(P＜0.05)，表明SMMC-7721细胞具有较强的迁移能力。2.0 μmol/L As2O3处理与未处理的SMMC-7721细胞在0 h划痕距离较一致，而处理12 h，24 h后，较未处理组明显增加(P＜0.05)，可呈时间依赖性抑制SMMC-7721细胞的迁移能力。

图1 三氧化二砷对SMMC-7721细胞迁移能力的影响

图2 三氧化二砷对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响

2.3 As2O3对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭能力的影响 图2可见，2.0 μmol/L As2O3处理SMMC-7721细胞12 h与24 h后，穿膜细胞数分别为(35.9±0.36)、(25.5±0.62)个，较未处理组的(55.6±0.48)、(42.3±0.52)个明显减少(P＜0.05)，表明As2O3可呈时间依赖性降低SMMC-7721细胞侵袭能力。

2.4 As2O3对SMMC-7721细胞MMP-9表达的影响 实时定量 PCR 显示，2.0 μmol/L As2O3处理SMMC-7721细胞6 h，12 h与24 h后，MMP-9 mRNA表达水平明显下调(10.08±0.15，6.54±0.13，4.02±0.05 vs 17.12±0.25，P＜0.05);Western印迹显示，2.0 μmol/L As2O3处理 SMMC-7721 细胞 12 h，24 h 与48 h后，MMP-9蛋白表达明显下调(0.84±0.23，0.82±0.21，0.52±0.02 vs 0.95±0.17，P＜0.05)。表明As2O3可呈时间依赖性明显下调MMP-9。见图3。

图3 三氧化二砷对SMMC-7721 MMP-9蛋白表达的影响

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭和转移是肿瘤患者死亡的主要原因。研究寻找有效的抗肿瘤转移药物一直是药物研发的热点〔7～9〕。阻断肿瘤细胞黏附、侵袭和迁移过程的各环节均有可能抑制肿瘤的转移〔10～14〕。

As2O3具有促进肿瘤细胞凋亡与诱导细胞分化、抑制端粒酶作用，近来不少学者也进行 了相关研究，提示As2O3也有抑制肿瘤细胞侵袭转移作用〔15，16〕，有望作为一种抗肿瘤转移药物运用于临床。

MMP-9是相对分子量最大的基质金属酶，主要降解和破坏Ⅳ型胶原。Ⅳ型胶原是阻碍肿瘤侵袭转移的关键屏障基底膜的主要成分，因此，MMP-9被认为是肿瘤局部侵袭和转移的重要分子。MMP-9在肿瘤侵袭和转移中发挥的重要作用，还包括调节细胞间的黏附和促进肿瘤血管的生成。

本研究结果表明，As2O3可呈剂量依赖性抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，呈时间依赖性抑制其迁移与侵袭，从mRNA与蛋白水平呈时间依赖性下调MMP-9。上述结果提示，As2O3抑制SMMC-7721细胞迁移与侵袭可能与下调MMP-9有关。进一步研究As2O3抑制人肝癌细胞迁移与侵袭，阐明其详细分子机制，对As2O3抑制肝癌侵袭与转移的临床应用具有重要意义。

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