东莨菪碱致学习记忆损伤大鼠不同脑区PREG含量的变化

李莎莎，侯艳宁

(1.承德医学院生理学教研室，河北承德 067000;2.白求恩国际和平医院药剂科)

神经甾体指在中枢神经系统合成的或经血脑屏障进入神经系统发挥作用的甾体及其代谢衍生物。孕烯醇酮(PREG)是胆固醇合成神经甾体过程中最初的产物，具有神经调节和神经保护作用[1-2]。本研究通过制备东莨菪碱致学习记忆损伤大鼠模型，检测模型动物相关脑区PREG的变化，初步探讨学习记忆损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠16只，购自河北省实验动物中心(合格证号909044)，体重200-220g。大鼠随机分为模型组及生理盐水对照组，每组8只。第1-5d定位航行实验前30min，模型组大鼠腹腔注射东莨菪碱(2.0mg/kg)制作学习记忆损伤模型，对照组注射等量生理盐水。

1.2 主要试剂及仪器 PREG，美国Sigma公司;氢溴酸东莨菪碱注射液，上海禾丰制药有限公司。HP-1100高效液相色谱－质谱系统，美国安捷伦公司;高效液相色谱系统，日本岛津公司;Oasis HLB 1cc固相萃取柱，美国Waters公司(30mg)。

1.3 实验方法

1.3.1 Morris水迷宫行为学测试:①第1-5d进行定位航行实验:将大鼠从固定入水点面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台的时间，即逃避潜伏期。②定位航行实验结束后间隔1d撤去平台，于第7d进行空间探索实验:将大鼠从原固定入水点面向池壁放入水中，记录大鼠第一次到达原平台所在位置的时间以及在180s内跨越原平台所在位置的次数。

1.3.2 样品采集、PREG提取及测定:空间探索实验结束后大鼠断头处死，迅速剥开颅骨在4℃生理盐水中分离额叶皮质及海马，称重后-70℃保存。参照文献的方法[3]，经乙酸乙酯/正己烷液液萃取和固相小柱两步法提取PREG并采用HPLC-MS法测定PREG含量。

1.4 统计分析 采用SPSS 11.5统计软件行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学测试结果 见表1-2。定位航行实验结果显示，第3d开始，模型组大鼠的逃避潜伏期明显长于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。空间探索实验结果显示，与对照组比较，模型组大鼠第一次到达原平台位置的时间显著延长(P＜0.05)，跨越原平台所在区域的次数显著减少(P＜0.05)。说明东莨菪碱致学习记忆损伤大鼠模型制备成功。

表1 大鼠定位航行实验结果(±s，单位:s)

表1 大鼠定位航行实验结果(±s，单位:s)

组别 n 第1d 第2d 第3d 第4d 第5d对照组 8 163.0±23.8 147.6±13.9 63.5±13.1 39.1±6.3 31.5±8.4模型组 8 172.8±15.9 143.9±21.5 149.1±24.1 96.0±39.9 53.9±24.0 P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 大鼠不同脑区PREG的含量 见表2。与对照组比较，东莨菪碱致记忆损伤大鼠额叶皮质PREG含量显著下降(P＜0.05);海马PREG含量无明显变化。

表2 大鼠空间探索实验成绩和不同脑区PREG的含量(±s，n=8)

表2 大鼠空间探索实验成绩和不同脑区PREG的含量(±s，n=8)

组别 空间探索实验成绩 PREG含量(ng/g)时间(s) 次数 额叶皮质 海马对照组 13.5±5.2 5.4±2.2 2.96±0.95 2.92±0.75模型组 41.0±17.9 2.6±1.9 2.02±0.56 2.89±0.93 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

3 讨论

东莨菪碱致学习记忆损伤动物模型，是广泛用于研究学习记忆损害相关机制以及筛选具有促进认知功能有效药物的动物模型之一[4]。乙酰胆碱(ACh)是记忆形成的重要神经递质，特别是皮质、海马等脑区的ACh参与许多认知功能的调节，正常大鼠学习过程中不同脑区ACh的释放量与大鼠的学习成绩和记忆策略有关[5-6]。胆碱能神经元对空间记忆的调节主要通过M受体介导，并可引起突触可塑性的改变。M受体拮抗剂东莨菪碱可通过阻断ACh的受体结合位点，引起胆碱能系统功能障碍，影响信息处理的早期阶段如信息的获取及编码，导致学习记忆受损。

记忆的获取、再现及存储巩固需要海马的参与，海马在空间记忆中的作用依赖于海马与不同皮质区域的相互联系，这些皮质部位的损伤可导致实验动物Morris水迷宫学习记忆能力下降。Morris水迷宫行为学实验中，动物在多次训练中学会通过视觉获取空间参考信息并寻找到固定位置的隐蔽平台，形成稳固记忆，这种记忆属于空间参考记忆。参与空间参考记忆形成的神经通路主要有两条，对视觉客体的记忆加工为枕叶-颞-前额叶皮质神经通路,对空间的记忆加工主要是枕叶-顶-前额叶皮质神经通路。研究发现，额叶皮质损伤的大鼠信息获取功能受损，此类大鼠在寻找平台的过程中显示出随机性和盲目性的特点[7-8]。

胆固醇在胆固醇侧链裂解酶(P450SCC)的作用下生成PREG，它是神经甾体合成过程中最初的产物，通过作用于多种细胞膜受体快速调节神经细胞的兴奋性和突触可塑性。研究发现，PREG可提高大鼠在T迷宫等实验中的学习能力[9]。PREG可通过拮抗GABAA受体、激动NMDA受体和sigma1受体导致动物脑组织ACh释放增加，具有改善学习记忆的作用，但具体机制尚不明确[10]本实验中M受体拮抗剂东莨菪碱致学习记忆损伤大鼠额叶皮质PREG含量显著下降，提示东莨菪碱可能通过影响PREG的合成而损伤大鼠的学习记忆能力。

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