丝胶对2型糖尿病大鼠海马nNOS表达的作用

李 强，颜 勇，苏哲君，陈志宏

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院口腔科)

海马与认知功能密切相关，可直接干预信息贮存和回忆，且是缺血损伤最敏感的脑区[1]。研究发现[2]，糖尿病时存在认知功能障碍，表现为学习、记忆和解决问题的能力下降。丝胶是蚕茧中的水溶性蛋白质，约占茧丝的30%左右，民间有蚕茧泡水降血糖的验方。本课题组的前期研究发现，丝胶可明显降低血糖和保护糖尿病时胰岛细胞损伤[3-4]。本研究拟通过观察2型糖尿病模型大鼠海马神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表达的变化，探讨丝胶保护糖尿病海马损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 48只清洁级雄性SD大鼠，购自河北医科大学实验动物学部，合格证号:712024。48只SD大鼠随机分组:正常对照组(n=12)，大鼠常规饲养，自由摄食、饮水;糖尿病模型组(n=12)，建立2型糖尿病动物模型后，不再做任何处理;丝胶治疗组(n=12)，建立2型糖尿病动物模型后，给予丝胶(2.4g/kg/d)灌胃35d;二甲双胍组(n=12)，建立2型糖尿病动物模型后，给予二甲双胍(55.33mg/kg/d)灌胃35d。

1.2 糖尿病动物模型的建立 链脲佐菌素，临用时用pH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液，按剂量25mg/kg连续腹腔注射(3d)，7d后以空腹血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。

1.3 实验药物与试剂 链脲佐菌素，美国Sigma公司;丝胶，彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供;盐酸二甲双胍，辽宁一成药业有限公司;血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司;兔抗nNOS抗体，美国Santa Cruz公司。

1.4 指标检测

1.4.1 血糖:各组大鼠禁食12h后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，3000r/min离心20min，取血清采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4.2 海马nNOS表达的检测及定量分析:大鼠取血后4%多聚甲醛灌流固定，取脑，截取视交叉平面至大脑横裂的一段脑组织，4%多聚甲醛后固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6μm，自海马水平部出现后取片。SP免疫组化染色观察海马水平部神经元nNOS的表达，一抗稀释度为1:100，DAB显色，苏木素复染细胞核。以细胞浆出现棕黄色颗粒为nNOS阳性反应，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用MiVnt图像分析系统定量分析免疫组化阳性结果:10×20倍显微镜下于海马水平部CA1区任意选取3个视野，以阳性产物面积与视野面积的比值作为nNOS的相对表达水平，每例标本选取5张切片，取平均值。

1.5 统计分析 采用SPSS 15.0统计软件分析数据，行方差分析和两两比较的q检验。

2 结果

2.1 血糖 与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组大鼠的血糖明显升高(P＜0.01);丝胶治疗组、二甲双胍组大鼠的血糖明显低于糖尿病模型组(P＜0.01)，且丝胶治疗组与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见附表。

2.2 海马神经元nNOS的表达 nNOS免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于海马水平部各区神经元的胞浆。与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组大鼠海马神经元nNOS的表达明显升高(P＜0.01);丝胶治疗组、二甲双胍组大鼠海马神经元nNOS的表达明显低于糖尿病模型组(P＜0.01，P＜0.05)，且丝胶治疗组与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见附表。

附表 各组大鼠的血糖和海马神经元nNOS的表达(±s)

附表 各组大鼠的血糖和海马神经元nNOS的表达(±s)

与糖尿病模型组比较:*P＜0.01，**P＜0.05;与二甲双胍组比较:#P＞0.05

组别 例数 血糖(mmol/L) nNOS正常对照组 12 10.83±2.03* 0.118±0.014*糖尿病模型组 12 29.45±4.82 0.155±0.019丝胶治疗组 12 13.20±4.09*# 0.130±0.017*#二甲双胍组 12 13.18±2.30* 0.137±0.018**

3 讨论

NOS有三种同工酶，分别是内皮细胞中的内皮型NOS、神经元中的nNOS和血小板、巨噬细胞、胶质细胞中的诱导型NOS，它们均可催化L-精氨酸产生一氧化氮(NO)[5]。nNOS是钙离子依赖性酶，主要存在于神经元内。生理情况下，nNOS的活性较低，通过合成NO发挥调节脑血流，介导神经元兴奋性毒性及炎性损害等多种作用[6]。但nNOS与脑组织缺血缺氧密切相关，脑血氧供应减少可导致其表达上调[7]。本研究亦证实了这一点。糖尿病微血管病变可使毛细血管基底膜增厚、血管内皮细胞发生增生性改变，使毛细血管管腔变狭窄，再加上糖尿病患者脂代谢紊乱引起血流减慢，导致脑血流量减低，脑组织缺血缺氧，因此海马nNOS的表达明显升高。海马缺血缺氧激活nNOS，导致NO过量生成[8]。NO是一种高度游离的气体分子，在肿瘤杀伤、免疫防御、血管平衡及神经传导等方面发挥重要作用[9]。神经系统内，一定量的NO可参与长时程增强(LTP)的产生与维持，但过量NO可产生神经毒性[10]。另外过量NO可与超氧阴离子结合介导多种细胞损伤。

我国糖尿病患者多以服用西药控制血糖，在长期服用西药的患者中，有很多人早期即可出现肝肾损害，因此西药的毒副作用不容忽视。蚕茧由丝胶和丝素两部分组成，我国应用蚕茧已有几千年的历史，但主要是将丝素用作衣料;丝胶是蚕丝中包被在丝素外面的高分子水溶性蛋白，具有多种生物学活性，但在缫丝时作为废料丢弃本研究发现，丝胶可明显降低2型糖尿病大鼠海马nNOS的表达，推测丝胶可能通过下调海马nNOS的表达减少海马内过量的NO，减轻NO导致的神经元毒性和细胞损伤，具有保护糖尿病时海马损伤的作用。

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