布鲁菌外膜蛋白16纯化方法的改进

杨 磊，张建坡，王相国，许 勤，靳亚平，王爱华

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

蛋白重组技术在传染病的诊断以及作为亚单位疫苗方面有着广泛的应用。高水平的重组蛋白表达是蛋白提纯以及其他应用的先决条件。高产量和高纯度的融合表达蛋白在生物化学、三维结构、免疫反应性和诊疗研究中有着广泛而重要的意义［1］。纯化的重组蛋白被用于多种传染性疾病包括布鲁菌病的诊断方法的研究。布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）感染引起的世界范围的重要人畜共患传染病之一，在我国属于二类传染病［2］。布鲁菌是革兰阴性、兼性细胞内寄生菌，主要通过黏膜上皮侵入机体，在脾脏、肝脏、乳腺、生殖器官等部位增殖和扩散［3］。人类通过食用被感染动物的产品或直接接触被感染动物而感染布鲁菌病。布鲁菌外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）暴露于细菌表面，在布鲁菌不同种之间具有高度的保守性，动物感染后可以产生针对不同蛋白的特异性抗体，引起免疫性保护反应［4］，布鲁菌外膜蛋白16（Omp16）属于第一组外膜蛋白，是一种免疫优势抗原和探测抗布鲁菌抗体的重要靶分子，几乎存在于所有已知的布鲁菌种型中［5－7］。因此用布鲁菌Omp16作为临床血清学方法的检测是非常可靠的，而这种方法的建立需要大量的布鲁菌外膜重组蛋白Omp16。为了获得布鲁菌外膜重组蛋白Omp16，本研究将其连接于PET32－a原核表达载体，进一步改良提纯方法，最终提高了Omp16产量和纯度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 布鲁菌活疫苗株S2株，由陕西省兽药监察所惠赠；pET－32a质粒由西北农林科技大学动物生物技术农业部重点实验室保存；大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞购自北京天根生物技术有限公司（天根公司）。

1.1.2 主要试剂 TaKaRa Taq、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ、dNTP、100bp DNA Ladder Marker均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒为天根公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank上发表的布鲁菌Omp16的基因序列，设计一对特异性PCR引物，并在上、下游引物的5′端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。引物序列如下：

Omp16F：CCGGAATTCATGCGCCGTATCCAGTCGATTG

Omp16R：ACGCGTCGACTTACCGTCCGGCCCCGTTGA

1.2.2 布鲁菌基因组DNA的提取与目的基因的扩增 从－70℃冰箱取出甘油保存的布鲁菌，室温融化，取50μL接种于5mL TSA液体培养基，37℃、200r／min振摇培养48h，取培养物在TSA平板上画线，37℃培养72h后，挑取单个菌落，接种5 mL TSA液体培养基，37℃ 振摇培养48h，高压灭菌，离心收集菌体，用基因组提取试剂盒提取布鲁菌的基因组DNA，操作方法按说明书进行。以提取的布鲁菌基因组DNA为模板，应用合成的引物，PCR扩增Omp16基因。反应条件如下：95℃10min，80℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环；72℃ 延伸10min。反应结束后用10 g／L的琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。PCR产物用小量胶回收试剂盒回收纯化。

1.2.3 基因的克隆与序列测定 将PCR回收产物和pET－32a载体用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切处理，经10g／L琼脂糖凝胶电泳，并按照试剂盒说明书进行胶回收。将回收得到的目的基因和载体于16℃连接3h。10μL的连接体系如下：10×T4Ligase buffer 1μL，Omp16回收片段0.5μL ，pET－32a载体1μL ，T4DNA ligase 0.5 μL，ddH2O至10μL。常规方法转入大肠埃希菌感受态BL21中，涂布于含Amp的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇菌6h，按照试剂盒说明书提取质粒，进行PCR及双酶切鉴定，鉴定正确的，送南京金斯瑞公司测序，测序结果在NCBI上进行比对。

1.2.4 目的蛋白的诱导表达 将重组质粒pET－32a－Omp16转化大肠埃希菌BL21后，挑取阳性克隆，接种于LB液体培养基中，摇床37℃、200r／min振摇培养过夜。取菌液按1∶100的比例接种至5 mL含Amp的LB培养基中，培养至OD600nm值为0.6～0.8时，加入终浓度1mmol／L的IPTG，30℃诱导表达6h。取培养后的菌液2mL以12 000r／min离心2min，弃上清，沉淀加100μL PBS和25μL Loading buffer，振荡混匀后煮沸10min，取20μL进行120g／L SDS－PAGE电泳。

1.2.5 蛋白纯化 500mL的培养液离心后在30 mL的细胞裂解液中裂解（100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，pH 7.4；并加入1mmol／L PMSF抑制蛋白质降解）。冰浴30min后，对悬浮液进行40W振幅和8s脉冲条件下超声处理10 min。上述处理样品在4℃、10 000r／min离心30 min。裂解液中的一小部分和离心后的沉淀物保存，用于SDS－PAGE分析，然后按照His Trap HP说明书中的步骤纯化目的蛋白。纯化过程中所用漂洗液成分 （100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，10mmol／L imidazole，pH7.4），洗脱液成分（100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，250 mmol／L imidazole，pH7.4），操作步骤按照 His Trap HP说明书进行。

1.2.6 使 用 Triton X－100 和 β－巯 基 乙 醇 纯 化Omp16蛋白 为了提高纯化技术和获得较高产量的纯化蛋白，改变裂解缓冲液成分（200mmol／L urea，100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，20 mmol／Lβ－mercaptoethanol，10mL／L Triton X－100，10mmol／L imidazole，pH 8.0），并在此条件下使用洗涤缓冲液［8］。500mL培养物经离心后加入到30mL改良后的裂解缓冲液中，加入1mmol／L PMSF抑制蛋白质的降解。悬浮液混合均匀后在40W振幅和8s脉冲条件下超声处理10min，室温条件下孵育1h，10 000r／min离心30min，然后按照HisTrap HP说明书中的步骤纯化目的蛋白。漂洗 液 成 分 （200mmol／L urea，100mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，10mmol／L imidazole，pH 6.3），洗脱液成分（200mmol／L urea，100 mmol／L NaH2PO4，10mmol／L Tris－HCl，250 mmol／L imidazole，pH4.5）。

2 结果

2.1 目的基因的扩增

将PCR扩增产物进行10g／L的琼脂糖凝胶电泳，在约500bp处出现一条特异性DNA条带，与预期得到的目的基因大小相符（图1）。

图1 PCR扩增的Omp16基因Fig.1 PCR amplification results of Omp16gene

2.2 目的基因原核表达构建

将pET32a重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，在琼脂糖凝胶电泳图上分别出现507bp的DNA条带和5 900bp的pET－32a载体条带（图2）。挑取阳性克隆送公司测序后表明，克隆的Omp16基因与GenBank上发表的布鲁菌Omp16基因序列的同源性为99%。表明目的基因表达载体已正确构建。

2.3 重组蛋白的诱导表达

将诱导表达的重组蛋白各取20μL进行120 mL／L的 SDS－PAGE 电泳，结果显示，得到了与Omp16分子质量相符的蛋白条带（图3）。

图2 pET32a－Omp16重组质粒EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET32a－Omp16with EcoRⅠand SalⅠdigestion

图3 诱导表达的Omp16重组蛋白Fig.3 The induced expression of Omp16recombinant protein

2.4 重组蛋白的纯化

原条件下，菌体超声裂解，细胞裂解液中重组蛋白的可溶部分非常少，大部分蛋白以包涵体的形式存在，而且纯化出来的蛋白也混有一定的杂蛋白。改良条件下，菌体经超声裂解，细胞裂解液中重组蛋白的可溶部分比较多，但是大部分蛋白仍以包涵体的形式存在，但是纯化出来的蛋白条带单一，表明蛋白纯度比较高，如图所示（图4和图5）。

图4 改良条件下Omp16重组蛋白的纯化Fig.4 The purification of Omp16recombinant proteins under improved conditions

3 讨 论

临床上，对于人和动物布鲁菌病的检测主要是通过血清学诊断的方法。而以脂多糖（LPS）作为检测的抗原通常会得到假阳性结果，近些年的研究表明，在布鲁菌所有的抗原中，布鲁菌外膜蛋白相比细菌裂解物、LPS有着更好的特异性和反应灵敏度［9］。因而在大肠埃希菌里，通过基因工程的方法，依靠重组蛋白技术建立起来的直接或者间接酶联免疫反应是诊断布鲁菌病的常用方法之一 。由此看来，高效率高纯度的蛋白重组表达技术对于未来布鲁菌的防控就显得尤为重要。

重组蛋白的表达技术通常使用大肠埃希菌表达系统，重组蛋白通常适应的标签有6×His，SUMO，MBP［10］。标签蛋白一般主要有两种作用：一方面有助于重组蛋白的可溶性表达，另一方面标签蛋白为后来重组蛋白的纯化提供了便利条件。在重组蛋白的诱导和纯化过程中，大多数的蛋白经常会以包涵体的形式存在，包涵体通常通过尿素处理，显著的增加了重组蛋白的可溶性，然后通过亲和层析的方法使得目的蛋白得以纯化。然而即使是这样有的蛋白即使是这样也无法纯化到，而且费事费力。因此，在本研究中，我们通过改进改进蛋白纯化方法，添加Triton X－100和β－巯基乙醇，通过改进菌体裂解液，漂洗液，洗脱液增加了可溶性蛋白的含量，同时提高了蛋白的纯度，这为以后临床上对于人和动物布鲁菌病的检测提供了便利，为以后实验研究提供了必要的物质材料。

一般动物在感染布鲁菌1周之后机体内会有抗体出现，检测血清中的抗体是布鲁菌诊断和检疫的主要手段［11］。血清学诊断包括试管凝集试验（SAT）、虎红平板凝集试验（RBPT）、补体结合反应（CFr）、全乳环状试验（CYT）等［12］。血清学检测方法较多，且各有特色，但目前还没有一种完美的方法［13］。因此，在实际工作中，最好用一种以上的方法相互配合。国内常用RBPT和CYT进行现场或牧区的大规模检疫，以SAT和CFr进行实验室最后确诊［14］。对于疑难的病例，还可选用抗球蛋白试验、巯基乙醇凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸时试验。本研究中，通过改进改进蛋白纯化方法，有效的提高了重组蛋白的可溶性和纯度，为临床上通过血清学诊断的方法并结合其他方法对布鲁菌病监测提供了便利。

克隆了布鲁菌Omp16基因，其蛋白在大肠埃希菌BL21成功进行了诱导表达，在原纯化条件下，目的蛋白主要存在于包涵体内，可溶性部分比较少，在改进条件下目的蛋白的可溶性部分显著增加，此外，在原来条件下目的蛋白纯化量比较少，有杂蛋白污染，在改进条件下蛋白纯化量有了比较显著的提高，没有杂蛋白污染。本研究中形成的纯化程序可能对其他在大肠埃希菌中作为包涵体表达的重组蛋白的高效纯化有所帮助。

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