H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT－PCR 检测方法的建立

罗思思，谢芝勋＊，刘加波，陈敏玫，杨进业，

邓显文1，谢志勤1，庞耀珊1，谢丽基1，范 晴1

（1.广西壮族自治区兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001；2.广西壮族自治区疾病控制中心，广西南宁530028）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科A型流感病毒属，根据表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出16种HA（H1～H16）和9种NA（N1～N9）［1］。AIV 是一种有囊膜、单股负链、分节段的RNA病毒，基因组分为8个节段，分别编码 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白［2］。

由于禽流感病毒基因组分节段的特征，AIV较易发生变异，主要有抗原漂移和抗原转换两种方式。前者由于聚合酶保真性较低，在病毒复制过程中，HA和NA基因有可能逐步发生核苷酸点突变，不断积累可使表面抗原发生显著的变化，产生新的变异株；抗原转换是当两种以上不同亚型的AIV共同感染同一细胞时，不同毒株的8个基因片段通过基因重排，产生新的毒株。变异后的毒株致病性是未知的，有可能突破种间屏障，直接传染给人类，造成的后果无法估量。2009年，甲型H1N1流感的暴发，该H1N1毒株的基因组就是由猪源、人源和禽源等不同来源的片段构成［3］。

自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省和浙江省等地先后发生不明原因重症肺炎病例。国家卫生和计划生育委员会3月31日通报，上海、安徽发生3人感染H7N9禽流感确诊病例，2例上海患者已死亡。自2002年以来，全球报道的人感染H7亚型AIV病例超过100人，临床表现由结膜炎至轻微的上呼吸道疾病甚至是肺炎［4］。H7N9亚型AIV以往仅在禽间发现，在荷兰、日本及美国等地曾暴发过禽间疫情，但从未发现过人的感染情况。此次人感染H7N9亚型AIV，是全球首次发现的新亚型流感病毒。截至2013年5月29日，全国已确诊H7N9亚型AIV感染131人，其中37人死亡，76人痊愈。

针对以上现状和目前的情势，急需建立H7N9亚型AIV的快速检测方法，多重实时荧光定量PCR已用于多种病原体的鉴别检测［5－6］。本研究设计了专门针对H7N9亚型AIV的引物和探针，建立双重实时荧光定量RT－PCR（Real－time RT－PCR）进行检测，既可确定H7N9亚型AIV感染，也可同时确定是否为单个H7、N9亚型AIV感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction试剂盒、反转录试剂和荧光PCR Premix ExTaq酶为宝生物工程（大连）有限公司产品；胶回收试剂盒为Axygen公司产品；pGEM－T Easy载体为Promaga公司产品。

1.1.2 毒株 AIV（H2N3、H4N5、H5N1、H7N2、H8N4和 H10N3）［6］RNA 由香港大学惠赠；AIV（H1N7和H11N9）由美国宾夕法尼亚大学惠赠；H7N9亚型AIV的阳性RNA由广西壮族自治区疫病控制中心惠赠；AIV（H3N2、H6N6、H9N2）［7－9］、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性喉气管炎病毒（ILTV）由广西壮族自治区兽医研究所分离保存。

1.2 方法

1.2.1 引物和TaqMan探针的设计 根据Gen－Bank中H7N9亚型AIV HA基因和NA基因的保守序列，参考2013年3月分离的H7N9亚型AIV杭州株A／Hangzhou／1／2013（H7N9）的 HA和 NA序列，分别设计了能检测H7亚型、N9亚型AIV的2对特异性引物和2条TaqMan探针，通过NCBI BLAST验证，保证引物扩增出对应的靶基因，不与其他亚型AIV发生交叉。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.2 RNA的抽提和反转录 按照 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction试剂盒说明书，抽提病毒的RNA，以RNA为模板进行反转录，反应体系如下：5×reverse transcriptase buffer 10μL，50pmol random primer（9mer）1μL，10mmol／L dNTP mixture 2μL，40Uribonuclease inhibitor 0.6μL，5 U／μL AMV reverse transcriptase 1μL，模板 RNA 1pg～1μg，DEPC水补足至50μL，将其反转录成cDNA。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 双重实时荧光定量PCR反应条件的优化20μL PCR反应体系：2×premixExTaq酶10μL，正、反引物和探针终浓度在 0.1μmol／L～0.8 μmol／L之间调整，cDNA 2μL，以无RNA酶的超纯水补足20μL。双重实时荧光定量PCR各循环参数和引物浓度等进行优化，确定最佳的双重实时荧光定量RT－PCR模式。

1.2.4 双重实时荧光定量PCR特异性试验 将AIV （H7N2、H11N9、H7N9、H1N7、H2N3、H3N2、H4N5、H5N3、H6N6、H8N4、H9N2和 H10N3）、NDV、IBV和ILTV的cDNA／DNA分别加入到双重实时荧光定量RT－PCR反应体系中进行扩增，检测其特异性。

1.2.5 质粒标准品的制备 以H7N9亚型AIV HA基因和NA基因全长引物分别与对应的cDNA模板进行PCR扩增，阳性产物经胶回收纯化后，连接到pGEM－T Easy载体，提取阳性克隆质粒AIVH7和AIV－N9，送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。根据分子质量及浓度计算各质粒的拷贝数。

1.2.6 双重实时荧光定量PCR敏感性试验 把AIV－H7和AIV－N9的质粒，10倍为梯度倍比稀释，同时加入到最佳的PCR反应体系中进行扩增，检验其敏感性。

1.2.7 双重实时荧光定量PCR重复性试验 按照上述反应体系和反应条件进行双重实时荧光定量PCR，模板是H7N9亚型AIV的cDNA阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差和变异系数来验证实时荧光定量PCR的批内重复性。在第4天、第7天后重复检测保存于－20℃的模板，来验证模板的稳定性及实时荧光定量PCR的批间重复性。

1.2.8 双重实时荧光定量PCR干扰性试验 将AIV H7和AIV N9质粒标准品按不同的拷贝数进行组合，分别用双重实时荧光定量PCR和单项荧光PCR检测，确定模板浓度相差较大时二者的检测是否存在干扰。

2 结果

2.1 双重实时荧光定量PCR条件的优化

对PCR引物浓度、反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定双重实时荧光定量RT－PCR中 H7－1、H7－2、N9－1和 N9－2引物对的最佳工作终浓度为0.2μmol／L，H7－3和 N9－3探针最佳工作终浓度分别为0.4μmol／L和0.2μmol／L，PCR的最佳反应模式为，94℃30s，94℃5s，60℃20s，40个循环；最后于40℃结束反应。

2.2 特异性试验结果

应用最佳反应条件，对AIV、NDV、IBV和ILTV核酸进行双重实时荧光定量PCR检测。结果显示（图1），H7N2AIV在FAM荧光通道（530nm激发光下）出现扩增曲线，在ROX荧光通道（610 nm激发光下）为直线，H11N9AIV在FAM荧光通道为直线，而在ROX荧光通道出现扩增曲线，H7N9亚型AIV在FAM和ROX荧光通道均产生扩增曲线，而其他亚型AIV和其他常见呼吸道禽病的病毒在FAM和ROX荧光通道检测均为直线，与试验设计相符。

图1 Real－time RT－PCR特异性试验结果Fig.1 The specificity assay of Real－time RT－PCR

2.3 敏感性试验结果

用所建立的双重实时荧光定量PCR分别检测AIV H7HA质粒和N9NA质粒，结果显示（图2和图3），H7亚型AIV的检测下限为1×101copies／μL，N9亚型AIV的检测下限为1×102copies／μL，因此，H7N9亚型AIV的检测限为1×102copies／μL。

图2 Real－time RT－PCR敏感性试验（FAM 通道）Fig.2 The sensitivity assay of Real－time RT－PCR（FAM channel）

图3 Real－time RT－PCR敏感性试验（ROX通道）Fig.3 The sensitivity assay of Real－time RT－PCR（ROX channel）

2.4 重复性试验结果

在批内重复性试验中，对H7N9亚型AIV cDNA模板进行3次平行双重实时荧光定量PCR，3个平行反应在相应的荧光通道下均获得扩增曲线，H7亚型AIV通道Ct值变异系数为0.8%，N9亚型AIV通道Ct值变异系数为1.0%，对上述模板，以相同反应条件3d和7d后进行批间重复试验，Ct值变异系数均小于3%。结果表明，本研究建立的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性良好，可以满足临床检测的要求（图4）。

2.5 干扰性试验结果

将AIV H7和AIV N9质粒标准品模板按不同浓度进行组合时发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度低时，仍可在不同的荧光通道下分别检测到2个模板，并与单重荧光PCR检测结果无显著差异。

图4 Real－time RT－PCR重复性试验结果Fig.4 The repeatability assay of Real－time RT－PCR

3 讨论

H7N9亚型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，接着陆续在浙江、江苏、河南、北京、台湾、山东、福建等地发现该病毒引起的病例，引起世界的广泛关注。H7N9亚型AIV的发病特征为典型的病毒性肺炎，发病急，病程早期均有高热（38℃以上）、咳嗽等呼吸道感染症状。发病5d～7d出现呼吸困难，重症肺炎并进行性加重，部分病例可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征并死亡，至今没有证据确认新型H7N9禽流感病毒能在人与人之间传播［10］。

此次发现的新型H7N9禽流感病毒是由不同亚型AIV通过抗原转换的方式发生基因重排产生的，在8个基因片段中，H7片段来源于浙江鸭群中分离的AIV，并可追溯至东亚地区野鸟中分离的相似病毒；N9片段与东亚地区野鸟中分离的AIV同源；其余6个基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）来源于H9N2AIV，病毒基因组比对和亲缘性分析显示H9N2AIV来源于中国上海、浙江、江苏等地的鸡群［11－12］。

本研究针对H7N9亚型AIV的HA基因和NA基因保守序列，通过Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其特异性和引物之间的二聚体，筛选出了2套荧光TaqMan探针和引物，构成专门针对H7N9亚型AIV的引物组和探针组。在常规PCR引物的基础上添加了一条标记2个荧光染料基团的核苷酸探针，在双重实时荧光定量PCR反应的退火过程中，探针被水解，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而达到实时检测的目的。通过优化引物和探针的浓度，得到最佳的反应条件，建立了H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT－PCR检测方法，一管检测既可确定H7N9亚型AIV感染，也可鉴别单个H7亚型或N9亚型AIV感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。

本研究建立的H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT－PCR检测方法，具有特异性强、敏感性高（是常规PCR的100倍以上）、稳定性好、操作简单和污染环境的机会少（不需要EB染色）等优点，而且整个反应可在30min左右完成，在同一反应体系中，加入2对引物和2条探针，同时检测2个目的基因，一管多检，省时省力。此外，扩增过程可以直接通过电脑实时观察，反应结束便可根据扩增曲线判定结果，结果判定更简便、直观和实用，从而实现对H7N9亚型AIV的快速检测，同时还可确定H7亚型AIV、N9亚型 AIV感染，应用前景广阔，对H7N9禽流感的早期诊断和有效防控具有重要意义。

［1］ 庞耀珊，谢芝勋，谢丽基，等.H5N1亚型AIV HA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析［J］.基因组学与应用生物学，2012，31（2）：109－116.

［2］ 彭 宜，谢芝勋，郭 捷，等.利用RT－LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型［J］.病毒学报，2013，29（3）：154－161.

［3］ 顾 敏，赵 国，宋庆庆，等.1株H6N5亚型禽流感病毒A／duck／Yangzhou／013／2008的全基因测序及遗传进化分析［J］.畜牧兽医学报，2011，41（4）：441－448.

［4］ 朱闻斐，高荣保，王大燕，等.H7亚型禽流感病毒概述［J］.病毒学报，2013，29（3）：245－249.

［5］ Xie Z，Xie L，Fan Q，et al.A duplex quantitative real－time PCR assay for the detection of Haplosporidium and Perkinsus species in Shellfish［J］.Parasitol Res，2013，112（4）：1597－1606.

［6］ Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.A multiplex RT－PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5，H7and H9hemagglutinin subtypes［J］.Mol Cell Probes，2006，20（3－4）：245－249.

［7］ Peng Y，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtybe avian influenza viruses by reverse transcription loop－mediated isothermal amplification assay［J］.Virol J，2011，8：337.

［8］ 周辰瑜，谢芝勋，宋 杨，等.H6亚型禽流感病毒RT－LAMP检测方法的建立［J］.微生物学通报，2011，38（12）：1855－1861.

［9］ 谢芝勋，董建宝，唐小飞，等.3株H9N2亚型禽流感病毒广西分离株全基因组序列的测定与分析［J］.中国人兽共患病学报，2007，23（9）：916－926.

［10］ Nishiura H，Mizumoto K，Ejima K.How to interpret the transmissibility of novel influenza A（H7N9）：an analysis of initial epidemiological data of human cases from China［J］.2013，10：30.

［11］ 毛 青.科学认识H7N9，有效防控人感染禽流感病毒［J］.第三军医大学学报，2013，35（8）：693－695.

［12］ Liu D，Shi W，Shi Y，et al.Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9viruses causing human infection：phylogenetic，structural，and coalescent analyses［J］.Lancet，2013，381（9881）：1926－1932.