急性胰腺炎大鼠肺组织cPKCα的变化＊

徐海燕，唐薇薇，李丽娟

(遵义医学院病理生理学教研室，贵州遵义 563099)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常见的急腹症，虽然其病因各不相同，但其病理过程均始于胰腺腺泡破坏引起胰腺组织发生急性炎症，继而病变局灶处释放大量的炎性细胞因子，通过“扳机样作用”触发炎症介质的“瀑布样级联放大反应”，使AP易于从局部病变发展成为全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，并进一步出现肺、肾、心、脑、肝等多脏器的损伤，甚至出现多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)而致患者死亡，这是AP严重演变的根源［1－2］。肺是AP最常累及的器官之一，急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是AP患者发生死亡的重要原因［3］。目前已经证实，细胞钙超载和核因子 －κB(Nuclear factor－kappa B，NF－κB)活化在AP炎症级联放大过程中发挥极为关键的作用［4］。已有研究表明，蛋白激酶 C(protein kinase c，PKC)与细胞钙通道的活动和NF－κB的活化有关［5－8］，但PKC是否参与AP发病中的细胞内钙超载和NF－κB活化，并造成包括ALI在内的多器官功能损害，目前尚不清楚。

本研究采用经典方法复制大鼠胆源性AP动物模型，观测AP大鼠肺组织传统型蛋白激酶Cα(Classical protein kinase c α ，cPKCα)的变化，以探讨cPKCα在AP引发的ALI中的可能作用，从而为AP的防治提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 戊巴比妥钠(上海化学试剂公司进口分装);牛磺脱氧胆酸钠(上海化学试剂站分装厂);小鼠抗大鼠cPKCα多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);淀粉酶试剂盒和总蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所);即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物分组 健康SD大鼠32只，雌雄不拘，体重220±20 g，鼠龄8～12周，由上海贝凯公司提供。将动物随机分为2组:假手术(SO)组(n=16)和急性胰腺炎(AP)组(n=16)。

1.3 AP模型复制 受试动物于实验前禁食12 h，自由饮水。参照文献方法［9］复制AP模型，即经胰胆管逆行加压注射3%牛磺脱氧胆酸钠(0.1 mL/100 g，推注速度为0.05 mL/30s)，SO 组仅开腹暴露胰腺并轻轻翻动，余操作步骤相同。

1.4 标本采集与测定

1.4.1 大鼠胰腺组织学检查 各组大鼠在接受相应处理后4 h、8 h，留取相同部位的胰腺及肺组织，采用10%福尔马林固定后，常规石蜡包埋组织切片，HE染色，光镜下观察其组织病理变化。

1.4.2 大鼠血清淀粉酶(amylase，AMY)活性检测 各组动物于相应处理后4 h、8 h，颈动脉采血2 mL，分离血浆后，采用721型分光光度计，用AMY测定试剂盒(碘－淀粉比色法)于660 nm处比色，检测AMY活性(U/L)。

1.4.3 检测大鼠肺组织cPKCα的蛋白表达变化 在各组大鼠接受相应处理后4 h、8 h，留取肺尖部组织，用常规方法制备成石蜡切片，采用免疫组织化学方法检测肺组织cPKCα的表达变化。具体操作步骤如下:①肺组织切片脱蜡至水化后，用胰酶在37℃条件下消化20 min，水洗;②0.3%H2O2甲醇液孵育10 min，水洗后用PBS液冲洗2次，5 min/次;③用牛血清白蛋白在室温条件孵育15 min，去掉组织切片上的液体;④直接滴加小鼠抗大鼠cPKCα多克隆抗体，放置于湿盒中4℃过夜，PBS液冲洗3次，5 min/次;⑤滴加IgG二抗，于37℃孵育20 min后，用PBS液冲洗3次，5 min/次;⑥滴加SABC工作液，在37℃条件下孵育20 min，PBS液冲洗3次，5 min/次;⑦DAB显色后自来水冲洗;⑧苏木素复染，通过无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，光镜下观察结果。用PBS代替特异性抗体作空白对照。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学变化 AP组大鼠胰腺外观充血水肿，体积增大，颜色变暗，可见多个暗褐色坏死灶，光镜下观察到胰腺腺泡表现为不同程度的肿胀，间质可见大量炎性细胞浸润及出血，随时间延长出现不同程度的局灶性或片状坏死，8 h胰腺组织中可见灶状钙皂形成;AP组大鼠肺组织呈现不同程度的充血性改变，包膜下可见点、片状出血灶，光镜下见肺泡壁增厚，肺间质水肿、出血、大量炎性细胞浸润，以8 h为显著。

2.2 血浆AMY的活性改变 AP大鼠各时间点血浆AMY的活性显著增高，以8 h为著，与SO组相比较，差异具有显著性(P＜0.05，见图1)。

图1 各组大鼠血浆AMY的活性比较

2.3 肺组织cPKCα的变化 免疫组织化学方法发现:cPKCα定位于细胞浆，阳性细胞在胞浆内呈现棕黄色颗粒。SO组大鼠肺组织细胞浆内仅见少量棕黄色颗粒，无明显细胞膜聚集的现象;而AP组大鼠的细胞浆可见大量棕黄色颗粒，且棕黄色颗粒聚集于细胞膜的一侧，以8h为著(见图2)。实验结果提示:AP组大鼠肺组织cPKCα蛋白的表达及活性明显增高。

图2 各组大鼠肺组织cPKCα的表达及活性比较典型图例(8h)×200

3 讨论

研究表明，ALI为AP尤其是急性重症胰腺炎常见的并发症，是AP患者病情危重演变导致死亡的重要原因。大量研究表明，AP时的肺损伤与肺组织内大量中性粒细胞、单核巨噬细胞积聚、活化，释放大量促炎因子有关［10－11］，但其具体机制尚不清楚。

PKC是真核生物中一类主要的蛋白激酶，有12种亚型，属于丝氨酸苏氨酸激酶超家族。PKC参与了细胞的生长分化、增殖、基因转录、细胞骨架蛋白的重塑等生物活动。在静息状态时，PKC以无活性的形式存在于胞浆，当其被激活时从胞浆转移至胞膜。cPKCs是PKC分布最为广泛的一类，包括 α、β1、β2、γ 四类。已有研究证实，各种途径引起的cPKCα活化，均可导致前列腺素E2、肺泡上皮细胞环氧化酶及单核细胞TNFα等的基因表达增加，其机制与cPKCα激活NF－κB有关;此外，有学者发现，cPKCα激活后可引起细胞膜和内质网的钙通道开放，使细胞内的钙离子浓度升高［5－8，12］。可见，cPKCα 参与细胞内 NF － κB 活化及钙离子浓度的调节。

大量研究已经证实，AP炎症级联放大反应与细胞内钙超载及NF－κB活化密切相关。有研究表明，cPKCα 的活化参与 AP的发生和发展［13－14］，但cPKCα－细胞钙超载－NF－κB活化通路与AP的关系尚不清楚。本课题通过向胰管内逆行加压注射3%牛磺脱氧胆酸钠，复制大鼠胆源性AP，AP复制成功后4h和8h均可观察到:肺组织细胞cPKCα的表达明显增加，且表达的cPKCα主要聚集于细胞膜的一侧。根据cPKCα激活时从胞浆向胞膜移位的特点，本研究认为，AP大鼠肺组织cPKCα的表达及活性均明显增加，提示cPKCα可能通过影响细胞钙超载及NF－κB活化通路参与AP大鼠ALI的发生。但其具体影响及机制还有待进一步研究。

［1］汤亲青，赵怀辉，李钟声.细胞因子在胰腺炎发生发展中的作用［J］.肝胆外科杂志，2009，17(05):397 －399.

［2］步丽梅，汤茂春，徐敏.环氧合酶－2与急性胰腺炎研究进展［J］.世界华人消化杂志，2010，18(18):1919－1922.

［3］Zhou M T，Chen C S，Chen B C，et al.Acute lung injuryand ARDS in acute pancreatitis:mechanisms andpotential intervention［J］.World J Gastroenterol ，2010，16(17):2094－2099.

［4］张红，李永渝，吴咸中.核因子－κB及钙超载与急性胰腺炎［J］.中国危重病急救医学，2004，16(12):764 －767.

［5］Yang S，Bing M，Chen F，et al.Autophagy Regulation by the Nuclear Factor kappaB Signal Axis in Acute Pancreatitis［J］.Pancreas，2011，41(3):367 －373.

［6］谢文瑞，陈垦，阳小雅，等.核因子－κB在急性胰腺炎中的激活及NBD多肽的干预作用［J］.世界华人消化杂志，2008，16(18):1980 －1984.

［7］Huang G，Yao J，Zeng W，et al.E R stress disrupts Ca －signaling complexes and Ca regulation in secretory and muscle cells from PERK － knockout mice［J］.J Cell Sci，2006，119(1):153 －161.

［8］Sarah Navina，Chathur Acharya，James P，et al.Ryanodine receptors contribute to bile acid－induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice［J］.Science Translational Medicine，2011，3:107 －110.

［9］施新猷.现代医学实验动物方法学［M］.北京:人民医学出版社，2001:460.

［10］徐岷，周国雄，黄介飞，等.中性粒细胞趋化因子在重症急性胰腺炎中的作用［J］.江苏医药，2006，32(2):141－143.

［11］Jean Louis Frossard，Se'bastien Lenglet，Fabrizio Montecucco，et al.Role of CCL－2，CCR －2 and CCR －4 in cerulein－induced acute pancreatitis and pancreatitis－associated lung injury［J］.Clin Pathol，2011，64:387 －393.

［12］黄晓莉，孙红霞.蛋白激酶C与糖尿病性及肥厚性心肌病的研究进展［J］.医学综述，2009，15(21):3222－3224.

［13］李丽娟，徐海燕，唐薇薇，等.急性胰腺炎大鼠胰腺组织 cPKCα 的变化［J］.遵义医学院学报，2010，33(5):418－420.

［14］王斌生，曹农，柴琛，等.蛋白激酶C在大鼠重症急性胰腺炎中的表达［J］.第四军医大学学报，2008，29(12):1081－1084.