Error-prone PCR致哈茨木霉几丁质酶突变的条件优化

王傲雪，李 微，陈秀玲，李景富

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

番茄真菌性病害已成为影响番茄生产的主要病害，严重影响番茄品质和产量[1]。哈茨木霉（Trichnderma harzianum）是一种广泛应用于植物真菌病害防治的重寄生真菌[2]，能够通过拮抗作用防治番茄灰霉病[3]。哈茨木霉菌株产生的包括几丁质酶在内的细胞壁降解酶[4]，在抑菌中起重要作用。在植物病害防治中，几丁质酶在有效防治植物病原真菌的同时，还可以刺激植物分泌几丁质酶，从而增强植物对病原菌的抵抗力，因而在生物防治中具有广阔的应用前景。

Error-prone PCR原理是利用DNA聚合酶不具备3'→5'校对性质，在PCR过程中出现碱基错配从而进行特定基因随机诱变的技术。此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物，因此易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一[5-6]。Nakaniwa等运用Errorprone PCR方法对一种耐热性果胶酸裂解酶（PL47）进行体外定向进化，得到3个低耐热的突变株，突变株在耐热性和耐热活力上均低于PL47[7]。Deng等运用Error-prone PCR方法对Escherichia coli氨基葡萄糖合成酶（GlmS）进行改良，得到10个突变株，其中一个突变株蛋白酶的活性为野生型的2倍[8]。Niu等通过DNA shuffling和易错PCR的方法对根霉菌脂肪酶进行定向改造，从而得到热稳定性提高的突变株，并证明对酶热稳定性和最适作用温度起决定性作用的位于190位点[9]。

本试验通过调整Error-prone PCR的试验条件：提高Mg2+浓度，加入Mn2+，调整dNTP比例等因素，得到使哈茨木霉几丁质酶基因产生突变的的试验条件，为后期对哈茨木霉几丁质酶进行体外定向进化，获得酶活大幅提高的突变酶奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由东北农业大学番茄研究所保存。

1.1.2 供试药剂

RNA提取试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、MgCl2、PCR Buffer购自北京全式金生物技术有限公司；dNTPs购自ToYoBo公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；DNA Marker、pMD18-T Vector试剂盒购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒（上海生物工程有限公司）；其他试剂均为国产，分析纯。

1.1.3 供试培养基

LB培养基：用于大肠杆菌及大肠杆菌转化子（加Amp后使用，每50 mL培养基加50 μL Amp）的培养、筛选。10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，5 g·L-1NaCl，15 g·L-1琼脂（Agar）配制固体培养基。1.05 kg·cm-2、121℃条件下灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉几丁质酶Chit42基因的诱导表达

8是一个吉利的数字，在中国人的传统语境中，8意味着财富的增长。但是在这个尾数是8的年份里，很多民众的感受中，这并不是一个好的年景。中国股市复制了2008年的大跌模式，股指在2018年开市的最后一天回落至2500点以下收盘，全年跌幅超过四分之一，1.46亿股民人均亏损近10万元。“二八规则”也被轻易打破，仅有一成股民侥幸赚了点钱。对于中国股市，这显然是一个没能逾越的寒冬。

将哈茨木霉（Trichoderma harzianum）接种到PDA培养基上活化，25℃恒温箱中培养5～8 d，直至产生大量绿色孢子，5 mL灭菌水浸泡3～5 min，轻刮洗下分生孢子，按8%的接种量接种至装有50 mL产酶发酵培养基和PD培养基的250 mL三角瓶中，置于恒温摇床，25℃，180 r·min-1培养5 d。

1.2.2 哈茨木霉总RNA的提取

将0.1 g菌丝置于研钵中，加入液氮充分研磨，迅速加入1.0 mL Trizol，剧烈震荡混匀，以剪切基因组DNA；加入200 μL氯仿/异戊醇（24∶1），剧烈振荡混匀30 s；4 ℃，12 000 r·min-1，离心5 min；将含有RNA的上清液小心转移到RNase-free 1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1，离心5 min，小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；用75%乙醇（DEPC水配制）洗涤两次，每次700 μL，12 000 r·min-1，4 ℃离心2 min，尽可能彻底吸走上清，防止RNA沉淀丢失。真空离心干燥3～5 min，或放在室温下使酒精完全挥发；沉淀用50 μL DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10 min。吸取3～5 μL RNA溶液用于下步检测反应，其余RNA溶液贮存于-70℃备用。

1.2.3 哈茨木霉总RNA的质量检验

对制备的RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计检测A260/A280比值。

1.2.4 反转录为cDNA的体系设定及反应条件

反转录体系：总 RNA 3 μL（约 1 μg），Oligo（dT）引物 1 μL，ddH2O 9 μL，混匀，稍离心，70℃，5 min，立即置于冰上，冷却2 min，稍混匀离心，按顺序加入下列物质：5×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 0.5 μL，RNA酶抑制剂（25 U）1 μL，MMLV 1 μL，混匀稍离心，42 ℃反应90 min。反应完成后，存于-70℃备用。

1.2.5 常规PCR扩增

Chit42H：5'CCAAGCTTACCTCTACCAACATC ACAAGCAA 3'

Chit42N：5'CGGCGGCCGCCAGCCTAGTTCAG ACCATTC 3'

以哈茨木霉cDNA为模板进行PCR扩增，每50 μL 体系：10×Taq Buffer（含 Mg2+）5 μL；dNTP（2.0 mmol·L-1）5 μL，引物各 1 μL（0.5 μmol·L-1），模板cDNA 2 μL，Easy-Taq 0.5 μL，ddH2O 35.5 μL。几丁质酶基因Chi42扩增的反应条件为：94℃，2 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min，共35个循环；反应结束后72℃延伸10 min。

1.2.6 Error-prone PCR扩增

以克隆的哈茨木霉几丁质酶基因为模板，在常规PCR基础上，尝试以下反应条件以及条件组合：①MnCl2浓度分别为：0、0.2、0.4、0.5、0.6 mmol·L-1；② MgCl2浓度分别为：1.5、2.5、5.0、6.0、7.0 mmol·L-1；③ dATP，dGTP 浓度为 0.04 mmol·L-1；dCTP，dTTP 终浓度梯度为 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1；④不同突变条件的联合应用。

根据以上试验结果，为获得适宜的突变率，将影响突变率的因素组合。保持其他组分和扩增条件不变，在 5.0 mmol·L-1Mg2+、0.5 mmol·L-1Mn2+、1.5 mmol·L-1dCTP和dTTP条件下进行易错PCR扩增。

1.2.7 Error-prone PCR引入突变的鉴定

琼脂糖电泳分离易错PCR产物，切下所需条带，电洗脱回收，使用pMD18-T载体系统，按厂家提供的操作程序克隆到pMD18-T中，随机挑选克隆，送华大基因公司测序。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增Chit42基因

2.1.1 哈茨木霉总RNA的提取

由图1可知，RNA由3条谱带组成：分别是28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。并且28SrRNA与18SrRNA条带亮度比大于2∶1。紫外分光光度检测A260/A280比值为1.95，说明总RNA质量较好，可以用于后续试验。

图1 哈茨木霉总RNAFig.1 Total RNA electrophoresis results of Trichoderma harzianum

2.1.2 RT-PCR扩增Chit42基因

以哈茨木霉cDNA为模板，进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图2）。结果表明扩增得到1 300 bp左右的片段，与预期条带大小相符。将此片段回收，回收产物连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，经菌落PCR以及酶切鉴定后，送菌液测序。测序结果经Blast比对，与哈茨木霉几丁质酶Chit42 cDNA（S78423）序列同源性达100%。

图2 RT-PCR产物电泳结果分析Fig.2 Electrophoresis analysis of RT-PCR amplification products

2.2 Error-prone PCR条件的确定

2.2.1 Mg2+浓度条件的确定

Mg2+的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用，增加Mg2+浓度能够稳定非互补的碱基对并能影响DNA聚合酶的活性，因此高浓度Mg2+可增加PCR非特异性扩增的效率，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而扩增不出条带。不同Mg2+浓度下PCR扩增结果见图3，可见浓度1.5、2.5、5.0 mmol·L-1均能扩增出目的片段，浓度为6.0、7.0 mmol·L-1无条带检出。

图3 不同Mg2+浓度下的Error-prone PCRFig.3 Error-prone PCR results conducted with different Mg2+concentration

2.2.2 Mn2+浓度条件的确定

Mn2+在PCR中通常作为替代Mg2+的天然辅助因子，MnCl2能够降低聚合酶对模板的特异性，因此Mn2+的加入更有助于突变的发生。不同Mn2+浓度下PCR扩增结果见图4，可见浓度为0.6 mmol·L-1时，基本得不到扩增产物，因此控制Mn2+的最高浓度为0.5 mmol·L-1。

2.2.3 dNTP浓度条件的确定

在Error-prone PCR中，将dATP、dGTP降至常规PCR浓度的20%，增加某些dNTP的浓度能够促进错误掺入。不同dCTP、dTTP浓度下PCR扩增结果见图5。可见dCTP、dTTP浓度2.0 mmol·L-1时无目的条带检出，因此控制dNTP各浓度配比为：dATP、dGTP 0.04 mmol·L-1；dCTP、dTTP最大浓度控制在1.5 mmol·L-1。

图5 不同dNTP配比下的Error-prone PCRFig.5 Error-prone PCR conducted with different dNTP concentration

2.2.4 不同突变条件的联合应用

根据离子浓度、dNTP配比的试验结果，为获得适宜的突变率，将影响突变率的因素组合。保持Error-prone PCR的其他组分和扩增条件不变，在5.0 mmol·L-1Mg2+，0.5 mmol·L-1Mn2+，0.04 mmol·L-1dATP和dGTP，1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP条件下进行扩增。扩增结果见图6，可见在该条件下扩增良好。

图6 Error-prone PCR产物电泳结果分析Fig.6 Electrophoresis analysis of Error-prone PCR products

2.2.5 Error-prone PCR致Chit42突变结果

共测定10个克隆，累积13 370个碱基，检测到57个突变，平均突变率为0.4%（见表1）。说明浓度为5.0 mmol·L-1Mg2+和0.5 mmol·L-1Mn2+，配合浓度为 0.04 mmol·L-1dATP，dGTP；1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP，能够有效的进行Error-prone PCR扩增，实现碱基的突变。

表1 错配PCR形成随机突变的类型Table1 Types of random mutation introduced by Error-prone PCR

3 讨论

随着基因工程发展及生物信息学对蛋白质功能分析深入，已开始在分子水平上对酶进行定向进化[10]。易错PCR进行随机突变简便易行，容易引入突变，突变频率高于传统的化学和物理诱变[11]，是目前实验室常用的蛋白质分子改造方法。一般易错PCR产生的突变率范围为0.2%～2%。结果共测定10个克隆，累积13 370个碱基，检测到57个突变，均为点突变，未出现缺失和插入性突变，平均突变率为0.4%。发生于A/T的突变占75.4%（43/57），其中转换（A→G，T→C）占52.6%，颠换（A→T，T→A；A→C，T→G）占 22.8%（A→T，T→A：19.3%；A→C，T→G：3.5%）。而发生于G/C的突变只占24.6%（14/57），其中转换（G→A，C→T）占22.8%，颠换（G→T，C→A）占1.8%，CG→GC的颠换突变未见产生。突变后生成A/T的占43.9%（25/57），生成C/G的占56.1%（32/57）。碱基发生转换的比例远大于颠换，表明在易错PCR过程中，碱基突变具有一定偏向性。可见在Errorprone PCR中，提高Mg2+浓度稳定非互补的碱基对；引入Mn2+降低聚合酶对模板的特异性；降低dATP，dGTP浓度，增加dCTP，dTTP浓度促进错误掺入，能够有效实现碱基突变，为后期建立突变库，筛选优良突变株、酶分子定向进化奠定基础。

[1]姚彬,王傲雪,李景富.哈茨木霉对4种番茄病原真菌抑制作用的研究[J].东北农业大学学报,2009,40(5):26-31.

[2]张丽莉,李景富,王傲雪.一株生防木霉菌株的鉴定及其对番茄保护酶的诱导作用[J].东北农业大学学报,2011,42(1):89-93.

[3]郭润芳,刘晓光,高克祥.拮抗木霉在生物防治中的应用与研究进展[J].中国生物防治,2002,18(4):180-184.

[4]李静,刘建军,赵祥颖.微生物几丁质酶的研究概况[J].山东食品发酵,2006(1):6-8.

[5]Cadwell R C,Joyce G F.Mutagenic PCR[J].PCR Methods Application,1994,3(6):136-140.

[6]Moore J C,Jin H M,Kuchner O,et al.Strategies for the in vitro evolution of protein function:Enzyme evolution by random recombination of improved sequences[J].Journal of Molecular Biology,1997,272(3):336-347.

[7]Nakaniwa T,Tada T.An in vitro evaluation of a thermostable pectate lyase by using error-prone PCR[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2004,27:127-131.

[8]Deng M D,Alan D.Grund.Directed evolution and characterization of Escherichia coli glucosamine synthase[J].Biochimie,2006,88:419-429.

[9]Niu W N,Li Z P,Zhang D W.Improved thermo stability and the optimum temperature of Rhizopus arrhizus lipase by directed evolution[J].Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,43:33-39.

[10]陈英,朱绮霞,张搏.基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化[J].生物技术通报,2011(4):181-185.

[11]黄瑛,蔡勇,杨江科.基于易错PCR技术的短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶基因BpL的定向进化[J].生物工程学报,2008,24(3):445-451.