污水中解有机磷细菌的筛选及解磷能力测定

郭 乐，申元英,2*

（1.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000;2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

有研究表明，磷是水体富营养化的主要限制因子〔1〕。水环境中的磷主要来自生活污水、工业废水和农业排水。人体代谢废物、含磷合成洗涤剂的大量使用，化肥、农药、水处理的废水含磷量均较高。废水经生化处理后，剩余的大部分磷随排水进入河道，这是城市附近河道中磷的主要来源〔2〕。农田中使用的磷肥，除被植物吸收利用的部分外，其余的相当部分通过雨水冲入水体。家畜家禽的废弃物及排泄物中的大量有机磷，随着雨水的冲刷进入水体。水体中磷逐渐增多，造成水体富营养化。近年来研究〔3-4〕发现，微生物也是控制和影响磷释放的重要因素，可直接参与水体中磷的循环，把不溶的有机磷化合物转化为可溶性磷，并可固定大量的磷在细菌细胞内〔5〕。本次研究从污水中分离纯化得到能够降解有机磷的细菌，筛选高效的有机磷降解菌，研究其解磷能力，为污水中的生物除磷提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 采集污水处理厂浓缩池水样，装入250 mL灭菌采样瓶中。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基 试验所需微生物培养基如下：

（1）富集培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基，为了使解有机磷细菌在培养基中形成生长优势，在培养基中加入适量卵黄液。

（2）有机磷固体培养基〔6〕：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min）冷却至50℃以下，立即加入60 mL卵黄稀释液，倒平板。其中，卵黄稀释液的制备〔7〕：用75%酒精擦拭鸡蛋外壳，敲破鸡蛋一端，流去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，按1：1比例加入无菌生理盐水，摇匀。

（3）蒙金娜培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，蒸馏水1000 mL，115 ℃灭菌30 min。

（4）有机磷液体培养基〔7〕：向1000 mL蒙金娜培养基中加入0.4 g酵母膏，再加入0.2 g用无水乙醇溶解过滤的卵磷脂。

1.2.2 解有机磷细菌的分离及纯化 用无菌移液管吸取5 mL水样加入到装有100 mL富集培养基的250 mL锥形瓶中，于30℃、130 r/min的恒温水浴摇床上富集培养5 d。

常规10倍稀释法稀释样品，分别从各个浓度的菌悬液中吸取0.1 mL，用涂布棒均匀涂布在有机磷固体平板上，每个稀释度做3个重复，以大肠埃希菌作为阴性对照。于30℃恒温培养箱中培养2 d，能产生透明溶磷圈的即为解有机磷细菌。挑取有机磷细菌，分区划线接种在有机磷固体平板上进行纯化，将纯化后的细菌接种在斜面培养基中，4℃冰箱保种。

1.2.3 解有机磷细菌的筛选及解磷能力测定 有机磷固体平板解磷能力测定〔8〕：将分离纯化后的菌株分别用接种针点接种在有机磷固体平板上，培养10 d，观察溶磷圈的大小，分别测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），并计算D/d的比值。

有机磷液体培养基中解磷能力测定：分别将菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、130 r/min，水浴恒温摇床上摇18 h，得到菌悬液。将1 mL的菌悬液转移至装有50 mL灭菌的蒙金娜有机磷液体培养基中，于30℃、130 r/min的水浴恒温摇床上培养7 d，采用过硫酸钾-钼锑抗分光光度法〔9〕连续7 d监测水样中水溶性磷含量。

2 结果

2.1 解有机磷细菌的分离纯化 从污水处理厂浓缩池采集的水样，通过富集培养后，得到解有机磷细菌共19株。将平板上产生溶磷圈的解有机磷细菌进过多次的分离纯化，在分离纯化过程中，其中的5株丧失解磷能力，最终得到具有降解卵磷脂能力的细菌共14株。

2.2 平板法测定菌株解磷能力及优势菌株的筛选将获得的14株解有机磷细菌分别用接种针点接种于单个的有机磷平板上（90 mm平板），在30℃的恒温培养箱中培养10 d。观察并测量溶磷圈大小及菌落大小，筛选其中溶磷圈较大的4株细菌做后续定量测定，见表1、图1。

表1 平板法测定解有机磷细菌的解磷能力

图1 OPB8、OPB15菌株溶磷圈的测定

由表1可以看出，通过10 d的培养，筛选出4株解磷能力强的菌株。其中OPB8菌株的溶磷圈最大，而其溶磷圈直径与菌落大小直径比例较小，OPB15号菌株溶磷圈稍小，但其比例最大。OPB17、OPB19解磷能力次之。上述4株细菌的在平板上的产生的溶磷圈大小均大于其余菌株，根据溶磷圈大小，只能初步测定解有机磷细菌的解磷能力，为了了解其分解有机磷的趋势，本试验采用液体培养法对其解磷能力进行了测定。

2.3 液体培养法测定解磷能力 由表2可见，连续7 d的监测培养液中水溶性磷含量，OPB17、OPB19菌株达到解磷峰值时，培养液中的水溶性磷含量达到8.11 mg/L和9.17 mg/L，解磷率分别为107.9%和135.1%，随着培养时间的延长，培养液中的水溶性磷含量降至6.52 mg/L、5.46 mg/L，但均比原培养液中的水溶性磷含量多。OPB15、OPB19菌株达到解磷峰值时，培养液中的水溶性磷含量达到5.14 mg/L和13.62 mg/L，解磷率分别为31.8%、249.2%。但7 d培养结束后，培养液中的水溶性磷含量降至1.43 mg/L和0.58 mg/L。使培养液中的水溶性磷含量分别降低了72.2%和95.7%。

表2 解有机磷细菌解磷能力（7 d）

2.4 解有机磷细菌解磷曲线 如图2所示，筛选出的4株解有机磷细菌对卵磷脂中磷的释放高峰在第3～4天，随后水溶性磷含量逐渐下降，这可能是菌体利用了分解出的无机磷。

图24株细菌解磷曲线

3 结论

从以上结果可以看出，从污水中分离出能够降解有机磷的细菌的解磷能力不同，其培养液中水溶性磷含量均表现为先升高后降低，说明这些菌株不但有分解有机磷的能力，还具有吸收、利用和储存磷的能力。

4 讨论

本次实验分离纯化筛选的4株细菌菌落直径均较大，可能与培养基中含有充足的卵磷脂有关。OPB8菌株的溶磷圈最大，但在液体培养基中的解磷能力降低，OPB19菌株的溶磷圈最小，但在液体培养基中的解磷能力最大，这可能与细菌分泌的解磷酶与有机磷的接触及培养条件有关〔10〕。赵小蓉等〔11〕认为，解有机磷细菌在分解化合物时，一部分磷被同化为细菌自身的有机磷，另一部分以磷酸盐状态储存在细菌细胞内。另有报道〔12〕指出，细菌生长到达静止期后，能吸收环境中的磷，以多聚磷酸盐的形式（异染颗粒）储存在细菌细胞内。本次实验中，4株解有机磷细菌的培养液中水溶性磷含量均有下降，可能与细菌生长利用了培养液中水溶性磷有关。本次试验为进一步研究解有机磷细菌的解磷机制及模拟实验奠定基础。

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