梁举春,严 冬
(1.西藏天知生物科技开发有限公司,西藏拉萨 850000;2.西藏自治区(成都)科技孵化园,四川 成都 610000)
冬虫夏草体外溶出度研究
梁举春1,严 冬2
(1.西藏天知生物科技开发有限公司,西藏拉萨 850000;2.西藏自治区(成都)科技孵化园,四川 成都 610000)
依据《药典》中的溶出度测定法进行冬虫夏草纳米粉胶囊、冬虫夏草粗粉胶囊及冬虫夏草药材的体外溶出实验.实验显示,冬虫夏草药材在10 min时溶出最多,冬虫夏草纳米粉胶囊及冬虫夏草粗粉胶囊都在40 min时达到溶出最高点,而纳米粉溶出度高达100%.结果表明,装入胶囊的冬虫夏草粉比未装入胶囊的冬虫夏草药材,溶出度稳定,且冬虫夏草纳米粉溶出度最高.
冬虫夏草;体外;溶出度
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体.夏初子座出土、孢子未发散时挖取,晒至六七成干,除去类似纤维状的附着物及杂质,晒干或低温干燥后即成.冬虫夏草具有补肾益肺,止血化痰的功效,临床常用于肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛,久咳虚喘,劳嗽咯血等症.本研究考察了冬虫夏草纳米粉胶囊、粗粉胶囊及冬虫夏草药材的溶出度,拟为最大化利用该传统名贵滋补中药材提供药学实验数据.
实验所用仪器包括,ZRS-8G智能溶出试验仪(天津大学仪器厂),HP1100高效液相色谱仪(安捷伦公司),Mettler-AB204电子天平(上海精密科学仪器有限公司).
实验所用药材包括,腺苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号,110879-200202,供含量测定用),冬虫夏草纳米粉胶囊(0.3 g/粒)、冬虫夏草粗粉胶囊(0.3 g/粒)及冬虫夏草药材均由西藏天知生物科技开发有限公司提供(批号,100101).实验所用药材经成都中医药大学吴启南教授鉴定为合格可用.
实验所用试剂包括,磷酸和甲醇为色谱纯、三蒸水(自制),其他试剂均为分析纯.
2.1.1 系统适用性试验.
1)对照品溶液的制备.精密称取腺苷1.4 mg,置10mL量瓶中,用90%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取溶液1 mL,置5 mL量瓶中,加 90%甲醇至刻度,摇匀,即得.
2)供试品溶液的制备.精密称定冬虫夏草粉末0.5 g共3份,分别置具塞锥形瓶中,精密加入90%甲醇10 mL,密塞,摇匀,称定重量,加热回流30 min,放冷,再称定重量,用90%甲醇补足减失的重量,摇匀,以0.45 μ m 微孔滤膜滤过,取续滤液,即得.
3)高效液相色谱柱温度的确定.参照《药典》2010年版(一部)冬虫夏草含量测定项下的方法[1],分别于色谱柱温度为30、35、40℃时进样,进样量各10 μ L,考察色谱柱温度变化对腺苷含量测定结果的影响,结果如表1所示.
从表1可以看出,色谱柱温度影响出峰时间,对峰面积影响较小,结合液相色谱图峰形综合考虑,选定液相色谱柱温度为35℃.
4)液相色谱流动相流速的确定.参照《药典》2010年版(一部)冬虫夏草含量测定项下的方法[1],分别于液相色谱流动相流速为0.8、1.0、1.2 mL/min时进样,进样量各为10 μ L,考察流动相流速变化对腺苷含量测定结果的影响,结果如表2所示.
表1 色谱柱温度变化对腺苷含量测定结果的影响
表2 流动相流速变化对腺苷含量测定结果的影响
从表2可以看出,随着流动相流速的增大,出峰时间与峰面积减小,但对测定结果腺苷的含量无明显影响,确定流动相的流速为1.0 mL/min.
综上,确定腺苷含量测定色谱柱温度为35℃、流动相流速为1.0 mL/min.
2.1.2 线性关系考察.
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以磷酸盐缓冲液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氢钠68.5 mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠31.5 mL,混合(pH6.5))~甲醇(85∶15)为流动相,流速1.0 mL/min,色谱柱温度35℃,检测波长为260 nm.分别精密吸取28 μ g/mL 腺苷对照品溶液 4 、6 、8、10、12、14 μ L 注入液相色谱仪进行测定.以峰面积为横坐标,进样质量为纵坐标图,绘制标准曲线,结果见图1,得线性回归方程,
由图 1可见,进样量在 0.112~0.392 μ g范围内,线性良好.
图1 腺苷线性关系图
2.1.3 准确度试验.
精密称定冬虫夏草粉末1.05 g共3份,分别置具塞锥形瓶中,精密加入 90%甲醇20 mL,密塞,摇匀,称定重量,加热回流 30 min,放冷,再称定重量,用90%甲醇补足减失的重量,摇匀,以0.45 μ m微孔滤膜滤过,取续滤液,作为已知浓度供试品溶液.
分别精密吸取3份提取液2mL,精密加入28 μ g/mL腺苷对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL,以90%甲醇补足4 mL,摇匀,以0.45 μ m 微孔滤膜滤过,取续滤液,分别作为准确度试验低、中、高浓度供试品溶液.
按照2.1.2项下的方法,分别吸取上述溶液各10 μ L,注入液相色谱仪,平均回收率为 104.01%,RSD为1.70,结果如表3所示.
表3 准确度试验结果
2.1.4 重复性试验.
精密称定冬虫夏草粉末0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入 90%甲醇10 mL,密塞,摇匀,称定重量,加热回流30 min,放冷,再称定重量,用90%甲醇补足减失的重量,摇匀,以0.45 μ m微孔滤膜滤过,取续滤液,作为重复性试验供试品溶液.按照2.1.2项下的方法,吸取上述溶液10 μ L,注入液相色谱仪,平行6份测定,结果如表4所示.
表4 重复性试验结果
实验结果表明,本方法重复性良好.
2.1.5 稳定性试验.
精密称定冬虫夏草粉末0.5 g共3份,置具塞锥形瓶中,精密加入90%甲醇10 mL,密塞,摇匀,称定重量,加热回流30 min,放冷,再称定重量,用90%甲醇补足减失的重量,摇匀,以0.45 μ m微孔滤膜滤过,取续滤液,作为稳定性试验供试品溶液.按照2.1.2项下的方法,吸取上述溶液 10 μ L,注入液相色谱仪,在不同时间测定,结果如表5所示.
表5 稳定性试验结果
实验结果表明,样品在8 h内稳定.
综上,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以磷酸盐缓冲液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氢钠68.5 mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠31.5 mL,混合(pH6.5))~甲醇(85∶15)为流动相,检测波长为260 nm,测定冬虫夏草中腺苷的方法准确高效.
2.2.1 供试品制备.
冬虫夏草纳米粉胶囊,药材粉碎成纳米粉,过300目筛,装入胶囊(0.3 g/粒),每杯 15粒;冬虫夏草粗粉胶囊,药材粉碎,过5号筛(80目),装入胶囊(0.3 g/粒),每杯15粒;冬虫夏草药材,取原药材,每一杯约4.0 g.
2.2.2 体外溶出度测定方法.
1)色谱条件与系统适用性试验.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以磷酸盐缓冲液(pH6.5)(取0.01 mol/L磷酸二氢钠68.5 mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠31.5 mL,混合(pH6.5))~甲醇(85∶15)为流动相,检测波长为260 nm,理论板数按腺苷峰计算应不低于2 000.
2)对照品溶液的制备.精密称取腺苷约1.4 mg,置10mL量瓶中,用90%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取溶液1 mL,置 5 mL量瓶中,加 90%甲醇至刻度 ,摇匀,即得 28 μ g/mL.
3)供试品溶液的制备.取冬虫夏草纳米粉胶囊、粗粉胶囊及原生药材,依照溶出度测定法[2],以450 mL盐酸缓冲液为溶出介质,温度为37℃±0.5℃,转速为 100 r/min 依法操作 ,于 10 、20、30、40、50、60、70、80 min分别取样10 mL,同时补充同体积溶出介质.样品液经微孔滤膜滤过,取续滤液,即得.
4)测定法.分别精密吸取对照品溶液10 μ L与供试品溶液 10~ 20 μ L,注入液相色谱仪,测定,即得.
冬虫夏草纳米粉胶囊溶出度测定结果见表6.
表6 冬虫夏草纳米粉溶出度/%
根据表6数据制出冬虫夏草纳米粉胶囊溶出度曲线如图2、3所示.
图2 冬虫夏草纳米粉胶囊溶出度曲线
图3 冬虫夏草纳米粉胶囊平均溶出度曲线
由表6及图2、3可知,冬虫夏草纳米粉胶囊在前10 min,溶出非常少,到达20 min时,大量溶出,溶出度高达97%,随着时间推移,药粉继续溶出,在40 min的时候到达溶出最高点,且溶出度基本达到100%.
冬虫夏草粗粉胶囊溶出度测定结果见表7.
表7 冬虫夏草粗粉胶囊溶出度/%
根据表7数据制出冬虫夏草粗粉胶囊溶出度曲线如图4、5所示.
图4 冬虫夏草粗粉胶囊溶出度曲线
图5 冬虫夏草粗粉胶囊平均溶出度曲线
由表7及图4、5可知,冬虫夏草粗粉胶囊在10 min时,部分溶出,溶出度为40%左右,随时间推移,粗粉继续溶出,在40 min处到达溶出最高点,溶出度为73%,未完全溶出.
冬虫夏草药材溶出度测定结果见表8.
表8 冬虫夏草药材溶出度/%
根据表8数据制出冬虫夏草药材溶出度曲线如图6、7所示.
图6 冬虫夏草药材溶出度曲线
图7 冬虫夏草药材平均溶出度曲线
由表8及图6、7可知,药材溶出无明显规律,溶出度升高,降低,又升高.分析造成这一状况的原因,可能是因为药材取样不均所致.
溶出后的冬虫夏草药材,继续置于溶出杯中,保持溶质温度37.5℃,放置过夜.取样,滤过,取滤液,用高效液相色谱法测定腺苷含量并计算溶出度,结果如表9所示.
表9 放置过夜后冬虫夏草药材溶出度/%
实验数据表明,放置一夜后,药材溶出度升高,有效成分几乎完全溶出.
1)有研究报道,冬虫夏草具有很强的细胞免疫功能,以及抗肿瘤、调节内分泌、调节心血管系统、抗菌等功能[3].据统计,野生冬虫夏草含粗蛋白29.1%~33%,粗脂肪 8.62%,总糖 13.94%~24.20%,粗纤维 18.5%,水分 10.8%,灰分 8.64%[4].此外,冬虫夏草中还含有氨基酸、脂肪酸、核苷类物质、甾醇、甘露醇、多糖等,这些成分是冬虫夏草发挥生理活性或药效的主要物质基础,其中核苷类物质中的腺苷是冬虫夏草最重要的活性物质之一[5].故本研究以腺苷为指标成分测定冬虫夏草的体外溶出度.
2)冬虫夏草纳米粉胶囊、冬虫夏草粗粉胶囊及冬虫夏草药材3者平均溶出度如表10所示.
表10 3者平均溶出度(%)
根据表10制出3者平均溶出度曲线如图8所示.
图8 3者平均溶出度曲线
由图8可知,未装入胶囊的药材因没有胶囊壳的溶解在10 min时溶出最多,装入胶囊的冬虫夏草粉都在40 min时达到溶出最高点,而纳米粉溶出度高达100%.总的来看,装入胶囊的冬虫夏草粉比未装入胶囊、直接整根溶出的冬虫夏草药材,溶出更充分,溶出度更稳定.
3)药物经纳米级粉碎机的高速振荡、研磨后可达300目的粉末,其细胞破壁率达100%以上,最细粒度可达100 nm,粉末粒度80%集中在100~500 nm之间.药物的吸收利用度常常受到吸收部位药物溶出速度的支配,纳米粒径的药物由于大的比表面积,增加了其暴露于介质中的表面积,促进了药物的溶解,因而可以提高药物的吸收度,纳米粒径的药物更容易穿透组织间隙,分布极广,也可以大大提高其生物利用度[6].冬虫夏草是我国特有的珍稀名贵中药材,素有“软黄金”之称[7],经纳米粉碎后,可提高药材利用率,从而节约保贵的药材资源.
:
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2010.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社,2010.
[3]Koh J H ,Yu K W,Suh H J,et al.Activation of macrophagesand the intestinal immune system by an orally adminis-tered decoction from cultured mycelia of cordyceps sinen-sis[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2002,66:407-411.
[4]王尊生,顾宇翔,周丽,等.冬虫夏草菌丝体固体发酵粉化学成分的分析[J].天然产物研究与开发,2005,17(3):331-336.
[5]刘高强,王晓玲,杨青,等.冬虫夏草化学成分及其药理活性的研究[J].食品科技,2007,(1):202-209.
[6]马应龙,李淑红.纳米中药的研究进展[J].安徽农学通报,2007 ,13(9):192-194.
[7]秦松云,赵纪峰,刘翔等.冬虫夏草市场现状调查及对策[J].时珍国医国药,2011 ,22(5):1236-1237.
Study on Dissolution of Cordyceps Sinensis in Vitro
LIANGJuchun1,YAN Dong2
(1.Tibetan Tian Zhi Biological Science and Technology Development Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China;2.Tibet Autonomous Region(Chengdu)Technology Incubation Park,Chengdu 610000,China)
According to the dissolution testing method of chinese medicines,dissolution experiment in vitro was done with cordyceps nano powder capsules,cordyceps sinensis coarse powder capsules and cordyceps sinensis herbs.The dissolution of cordyceps sinensis herbs was up to maximum at 10 minutes.Cordyceps nano powder capsules and cordyceps sinensis coarse powder capsules achieved the dissolution to the highest point at 40 minuteswhile the Nano powder dissolution was up to 100%.The experimental results show that the dissolution of cordyceps sinensis powder into capsules is more stable than that of cordyceps sinensis herbs which are not loaded into capsules and the dissolution of Cordyceps sinensis nano powder capsules is the highest.
cordyceps sinensis;in vitro ;dissolution
R284.1
A
1004-5422(2013)01-0015-05
2013-01-15.
梁举春(1973—),男,高级工程师,从事中药药品与保健食品研究.