银杏内酯B对老龄大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤炎症反应的作用

刘 晖 张嘉伟 林 宇 王秀清 赵旭伟 (齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江 齐齐哈尔 161042)

研究表明脑缺血-再灌注损伤可引起严重的神经功能障碍，而银杏叶提取物主要活性成分银杏内酯B对脑缺血/再灌注后脑组织具有保护作用〔1〕。尼莫地平对脑缺血-再灌注脑损伤有明确的保护作用〔2，3〕。本实验观察银杏内酯B对脑损伤脑组织含水量及炎症因子和相关细胞黏附分子表达水平的影响，探讨其治疗缺血性脑血管病炎症修复的效果。

1 材料和方法

1.1 动物 60只SD老龄大鼠，雌雄各半，体重400～650g，鼠龄20～22月龄。随机分为假手术组、模型组、尼莫地平(4 mg/kg)组和银杏内酯 B(2.5、5.0、10mg/kg)治疗组，每组10只。

1.2 药物与试剂 水合氯醛(中国医药上海化学试剂公司);尼莫地平注射液(北京双鹤药业股份有限公司，批号:120731);银杏内酯B(南京泽朗医药科技有限公司，批号:101201);其他试剂为国产分析纯。

细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)试剂盒(美国TBI公司，批号:20110501);白介素(IL)-6、IL-1β放免试剂盒(上海海军医学工程研究所，批号:20121006);TNF-α ELISA试剂盒(南京建成生物公司，批号:20110906)。

1.3 实验方法 假手术组和模型组只注射等体积的生理盐水，尼莫地平和银杏内酯B组分别注射相应剂量的药物，各组动物舌下静脉注射给药，1次/d，连续3 d，最后一次给药1 h后，采用Longa法制作老龄大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型〔4〕。老龄大鼠腹腔注射乙醚麻醉后固定于手术台，行颈部正中纵行切口，行气管插管，小心分离双侧颈总动脉，避免伤及迷走神经，用无创动脉夹夹闭双侧动脉和基底动脉30 min，然后松开动脉夹使血流再通，即复制出脑缺血再灌注模型。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不夹闭。无菌缝合后回笼饲养。

1.4 测定项目 干湿法测定脑组织含水量:处死老龄大鼠，快速断头取脑。将大脑半球用滤纸吸去表面残血，称湿重后置105℃烘箱烤干至恒重，再秤干重，计算脑组织含水量。脑组织含水量(%)=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%〔5〕。

缺血再灌注72 h后断头取脑。用冷PBS冲洗3次，滤纸吸干，用冷的生理盐水配成10%脑组织匀浆，匀浆液4℃最大速度离心10 min，取上清液，用ELISA试剂盒分别测定脑组织中ICAM-1、E-selectin和TNF-α的表达水平。

血清IL-6、IL-1β含量测定:缺血再灌注72 h后，取静脉血3 ml，3 000 r/min离心5 min后取上清，按照RIA试剂盒说明进行测定。

2 结果

2.1 银杏内酯B对老龄大鼠脑组织含水量的影响 脑缺血再灌注后，模型组老龄大鼠的脑组织含水量显著高于假手术组(P＜0.01)，经过阳性对照药物尼莫地平处理后脑组织含水量显著降低(P＜0.01)，银杏内酯B各剂量组可降低缺血再灌注后老龄大鼠的脑组织含水量，且具有浓度依赖性，含水量随给药浓度的升高呈降低趋势(P＜0.01或P＜0.05)，最高剂量组(10.0 mg/kg)含水量的降低程度最显著，较尼莫地平组降低脑水肿能力更显著。见表1。

2.2 银杏内酯B对脑缺血再灌注老龄大鼠脑组织ICAM-1和E-selectin表达水平的影响 与假手术组比较，模型组ICAM-1和E-selectin的表达水平显著升高(P＜0.01);银杏内酯B组和尼莫地平组ICAM-1和E-selectin的表达水平均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明显剂量-效应依赖关系。见表1。

2.3 银杏内酯B对脑缺血再灌注老龄大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响 与假手术组比较，模型组 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量显著升高(P＜0.01);银杏内酯B组和尼莫地平组IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明显剂量-效应依赖关系。见表1。

表2 银杏内酯B对脑缺血再灌注老龄大鼠脑组织含水量、ICAM-1、E-selectin表达水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响(±s，n=10)

表2 银杏内酯B对脑缺血再灌注老龄大鼠脑组织含水量、ICAM-1、E-selectin表达水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响(±s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 剂量(mg/kg)脑组织含水量(%)ICAM-1(ng/ml)E-selectin/(ng/ml) IL-6/(ng/L) IL-1β/(ng/L) TNF-α(mg/g)假手术组 - 75.84±1.162) 0.86±0.192) 12.49±3.172) 97.12±16.712) 137.48±21.492) 0.41±0.072)模型组 - 85.12±2.31 1.49±0.53 20.67±6.37 197.18±21.58 287.27±31.29 1.49±0.71尼莫地平组 4.0 79.18±1.492) 0.97±0.372) 10.19±5.072) 124±16.492) 149.17±19.782) 0.57±0.462)银杏内酯B 2.5 81.21±2.181) 1.29±0.371) 14.34±4.971) 179.25±12.491) 197.28±14.191) 1.07±0.621)银杏内酯B 5.0 80.12±1.461) 1.28±0.441) 12.04±3.711) 159.28±12.791) 164.47±13.291) 0.72±0.241)银杏内酯B 10.0 78.94±1.212) 1.01±0.232) 10.18±2.492) 132.19±21.482) 148.19±20.072) 0.61±0.492)

3 讨论

脑缺血-再灌注损伤引起的脑血管病是临床常见的致死性疾病之一，尤其对高龄患者而言，危害极大，致死率、致残率极高〔6，7〕。脑缺血-再灌注过程作用机制复杂，主要通过兴奋性氨基酸、氧自由基、细胞因子等刺激与炎症有关的细胞因子表达，包括 TNF-α、IL-6、IL-1β、E-selectin、ICAM-1 等，从而促进中性粒细胞黏附及迁移，导致炎症反应。但是过度的炎症反应不仅影响局部的血液供应，而且可以直接破坏组织结构，加重脑损害及脑水肿症状，从而造成脑组织损伤。

本实验中给老龄大鼠构建脑缺血-再灌注模型后，缺血区脑组织发生明显坏死，模型组动物脑组织含水量显著增高，预示脑水肿的发生，同时组织中E-selectin、ICAM-1的表达水平和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量显著增高;通过预先给予不同剂量的银杏内酯B处理3 d，能显著减轻脑水肿症状，减少脑缺血-再灌注后炎症介质的释放，表明银杏内酯B在减轻脑缺血组织的炎症反应上具有显著效果，其效果与尼莫地平具有比较性，可以说明其是治疗脑血管疾病、减轻缺血性脑损伤炎症反应的潜在药物〔8，9〕，但其作用机制，还需要进一步研究。

1 Gu JH，Ge JB，Li M，et al.Inhibition of NF-kappa B activation is associated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2012;47(4):652-60.

2 赵士弟，黄 丽，姜之全，等.金雀异黄酮预适应对大鼠小脑浦肯野细胞缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(13):2758-60.

3 乐乐乐，董 志.利莫那班对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(12):2226-8.

4 Huang MH，Qian YS，Guan T，et al.Different neuroprotective responses of Ginkgolide B and bilobalide，the two Ginkgo components，in ischemic rats with hyperglycemia〔J〕.Eur J Pharmacol，2012;677(1-3):71-6.

5 Ma SW，Yin HF，Chen LY，et al.Neuroprotective effect of ginkgolide K against acute ischemic stroke on middle cerebral ischemia occlusion in rats〔J〕.J Nat Med-Tokyo，2012;66(1):25-31.

6 Yang ZZ，Li J，Li SX，et al.Effect of ginkgolide B on striatal extracellular amino acids in middle cerebral artery occluded rats〔J〕.J Ethnopharmacol，2011;136(1):117-22.

7 Fang WR，Deng Y，Li YM，et al.Blood brain barrier permeability and therapeutic time window of Ginkgolide B in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2010;39(1-3):8-14.

8 Wang JT，Jiang SY，Kwong JMK，et al.Nuclear factor-kappa B p65 and upregulation of interleukin-6 in retinal ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2006;1081:211-8.

9 金 晶，董宇翔，李 戈.银杏叶提取物在老年性疾病治疗中的应用进展〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(6):596-8.