8种油茶蒲提取物中活性物质含量及其抗氧化能力的比较研究

李利敏 沈建福 吴晓琴

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058)

油茶(Camellia oleifera Abel)是我国特有的木本油料树种，也是世界四大食用木本油料树种之一，山茶油被称为“东方橄榄油”。油茶在中国南方各省分布广泛，以湖南、江西、广西、浙江和湖北等省栽种面积最大，国外在日本、缅甸、越南等国家也有少量分布。我国的油茶栽培物种，按照花的色泽可分为白花油茶、红花油茶和黄花油茶3大类;其中尤以白花油茶类(普通油茶)栽培历史最久、分布面积最广［1］。

油茶蒲又称茶包，为油茶果的外壳，占油茶果鲜质量的60% ～70%，是油茶生产过程中的废弃物，每年产生的油茶蒲有近百万吨之多［2］，常被丢弃或作为燃料，利用率极低。长时间来国内外对于油茶蒲利用研究主要集中于茶皂素提取［3］与活性碳制备［4］，随着对油茶蒲研究的不断深入，人们发现其具有很强的生物活性，例如油茶蒲多糖具有极强抗氧化作用、抗癌活性［5］;油茶蒲醇提物对脂肪酸合酶(FAS)有极强抑制作用，使其成为潜在的减肥降脂功能因子［6］;陈秋平等［7］首次在普通油茶茶蒲醇提物中分离鉴定出3－O－甲基鞣花酸－4'－O－β－D－吡喃葡萄糖(MEAG)，通过细胞试验发现，MEAG具有极强的促进成熟脂肪细胞内脂肪分解作用，可能是油茶蒲提取物减肥降脂的关键化合物之一。油茶蒲提取物对5α－还原酶也有较强抑制作用，能明显改善丙酸睾酮导致的大鼠良性前列腺增生症状［8］。

国内外大多数研究往往局限于一个品种，由于不同油茶品种之间差异性比较显著，油茶蒲提取物中活性物质的含量及其生物活性亦具有一定的差异。本研究选择常见的8种油茶品种(浙江红花油茶、小果油茶、攸县油茶、大果红花油茶、博白大果油茶及仙居、三江、常山普通油茶)，研究比较油茶蒲提取物中活性物质含量及其抗氧化活性，为更好的开发和利用油茶蒲提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

浙江红花油茶(Camellia chekiangoleosa Hu):浙江省衢州市常山县;普通油茶(Camellia oleifera A-bel):浙江省仙居县、三江县、常山县;小果油茶(Camellia meiocarpa Hu):广西壮族自治区三江侗族自治县;攸县油茶(Camellia yuhsienensis Hu):采湖南省株洲市攸县;大果红花油茶(Camellia semiserrata Chi):广西梧州藤县;博白大果油茶(Camellia gigantocarpa Hu):广西省玉林市博白县。

1.2 仪器与试剂

RE－52AA旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;SHB－III循环水式多用真空泵:上海豫康科教仪器设备有限公司;TU－1810紫外－可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;Alliance 2695高效液相色谱仪、2996紫外检测器:美国Waters公司。

人参皂素Re(纯度＞98%):上海融禾医药技术发展有限公司;焦性没食子酸(纯度＞98.5%):国药集团化学试剂有限公司;芦丁标准品(纯度＞95%)、2，2－二苯基 －1－苦基肼(DPPH):美国 Sigma公司;Folin－Ciocalteu试剂:北京鼎国生物技术有限责任公司;乙腈(色谱纯)、乙酸(色谱纯):美国Merk公司;鞣花酸标准品(纯度97%):比利时Acros公司;没食子酸标准品(纯度＞99%)、2，4，6－三吡啶基三嗪(TPTZ):上海阿拉丁试剂有限公司;3－O－甲基鞣花酸－4'－O－β－D－吡喃葡萄糖(MEAG)标准品(纯度＞95%):实验室自制;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 油茶蒲醇提物制备

将新鲜油茶果外壳晒干，去除霉变、虫害后粉碎，过60目筛，按照1∶10料液比加入50%乙醇(体积分数)溶液，热回流提取1 h，过滤后减压浓缩至干粉，得到油茶蒲提取物(oiltea camellia extracts，OCE)。测定时将此油茶蒲提取物用50%乙醇溶液超声溶解，作为待测样品液。

1.4 8种油茶蒲提取物中活性物质含量测定

1.4.1 多糖含量标准曲线测定

葡萄糖标准曲线测定:采用苯酚－浓硫酸法，精密吸取标准葡萄糖贮备液(0.098 mg/mL)0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，各以蒸馏水补充至 2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混匀后迅速加入浓硫酸5.0 mL，静置10 min，混匀后于室温下放置20 min，以蒸馏水作为空白对照，在490 nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标(X，mg/mL)，以吸光值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，测定回归方程为Y=56.906X+0.014 4，R2=0.997 2。

1.4.2 黄酮含量标准曲线测定

芦丁标准曲线测定:采用紫外直接测定法［9］，精密吸取芦丁贮备液(1.044 mg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于10 mL 具塞试管中，用 50%乙醇(体积分数)定容至刻度，摇匀，静置10 min后，以试剂空白为参照，于360 nm处测定吸光值。以芦丁标准溶液质量浓度为横坐标(X，mg/mL)，以吸光值为纵坐标(Y，A360)绘制标准曲线，测定回归方程为Y=28.843X+0.018 7，R2=0.997 4。

1.4.3 皂苷含量标准曲线测定

人参皂苷标准曲线测定:精密吸取人参皂苷Re标准溶液(1.0 mg/mL)50、100、150、200、250 μL，氮气吹干溶剂，分别加入0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸，0.8 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴15 min，取出放置冰水中冷却，加入5 mL冰乙酸稀释，在548 nm波长处测定吸光值，同时以试剂空白做参照。以人参皂苷含量为横坐标(X，μg)，以吸光值为纵坐标(Y，A548)绘制标准曲线，回归方程为Y=0.002 2X－0.021 3，R2=0.994 4。

1.4.4 多酚含量标准曲线测定

没食子酸标准曲线测定:精密吸取没食子酸标准溶液(0.1 mg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL Folin－Ciocalteu试剂，加入2 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，充分混合后，室温放置1 h，于760 nm波长下测定吸光值，以没食子酸质量为横坐标(X，mg)，吸光值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，回归方程为Y=13.437X+0.035 7，R2=0.998 4。

1.4.5 样品测定

吸取一定量油茶蒲提取液，按照上述标准曲线测定方法，分别测定油茶蒲提取物中多糖、黄酮、皂苷及多酚含量。

1.5 油茶蒲提取物抗氧化活性测定

1.5.1 DPPH自由基清除率测定

测定方法在Zhou等［10］方法上稍作修改，将1.0 mg/mL油茶蒲提取物用50%乙醇溶液稀释成不同浓度梯度(25.0、20.0、15.0、10.0 和 5.0 μg/mL)，各取1.0 mL上述样品液于试管中，再加入3.0 mL质量浓度为0.04 g/L DPPH溶液，混合均匀，室温避光反应30 min后在517 nm处测定吸光值，以抗坏血酸为对照，清除率按照下面公式计算:

清除率 =［1－(Ai－Aj)/A0］×100%

式中:A0为未加样品时DPPH溶液的吸光值;Ai为加入样品后溶液的吸光值;Aj为样品溶液的吸光值。

1.5.2 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力测定采用FRAP方法。参照Zou等［11］的方法，将 1.0 mg/mL油茶蒲提取物用 50%乙醇溶液稀释成不同浓度梯度(30.0、25.0、20.0、15.0 和10.0 μg/mL)，取 1.0 mL 样品溶液加入到3.0 mL 工作液中(10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mol/L 醋酸缓冲液以 1∶1∶10 比例混合，预热至37℃备用)，摇匀后于37℃水浴中静置10 min，593 nm波长处测定其吸光值。另以 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L FeSO4测定绘制标准曲线，样品的抗氧化活性以达到同样吸光度值所需的FeSO4毫摩尔数表示。

1.6 HPLC测定油茶蒲提取物多酚类物质特征化合物

1.6.1 检测色谱条件

色谱柱:Luna C18(250 mm ×4.60 mm，5 μm);柱温:25℃;进样量:10 μL;流速:1.0 mL/min;检测波长254 nm;流动相A:乙腈;流动相B:1%乙酸水溶液;梯度洗脱:0～8 min，5%～10%A;8～16 min，10%A;16～25 min，10%～15%A;25～30 min，15%A;30～35 min，15%～20%A;35～40 min，20%A;40～45 min，20%～5%A;45～50 min，5%A。

1.6.2 标准曲线测定

精密吸取没食子酸标准贮备液(21.6μg/mL)0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度;精密吸取鞣花酸标准贮备液(22.3 μg/mL)0.2、0.4、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用二甲基亚砜定容至刻度;精密吸取 MEAG标准贮备液(22.6 μg/mL)0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

将上述不同质量浓度标准品溶液摇匀过0.45 μm滤膜后按照1.6.1项色谱条件进样检测。以标准品质量浓度为横坐标(X，μg/mL)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。没食子酸标准曲线为Y=19 695X －51 865，R2=0.999 8;鞣花酸标准曲线为Y=78 126X －211 683，R2=0.999 4;MEAG 标准曲线为 Y=44 636X －20 345，R2=0.999 9。

1.6.3 样品液测定

取已经制备好的油茶蒲提取液，过0.45μm滤膜后按照1.6.1项色谱条件进样检测。然后根据峰面积，从1.6.2项标准曲线上计算出特征物质含量。

2 结果与分析

2.1 8种油茶蒲提取物中活性物质含量测定

根据样品吸光度值，由标准曲线计算出8种油茶蒲提取物中活性物质含量。从图1可知，各个品种油茶蒲提取物多糖含量都比较高，不同品种油茶蒲提取物多糖含量之间存在一定差异性，攸县油茶茶蒲提取物多糖含量最高，浙江红花油茶茶蒲提取物多糖含量最低;由图2可知，浙江红花油茶茶蒲提取物黄酮含量显著高于其他品种，博白大果油茶茶蒲提取物黄酮含量最低;由图3可知，相比与其他活性物质，油茶蒲提取物中皂苷含量最高，其中又以小果油茶和博白大果油茶茶蒲提取物皂苷含量最高，其他品种之间皂苷含量差别不是很大，现今，主要从压榨完的油茶籽饼粕中提取茶皂素，结果表明，油茶蒲皂苷含量也非常高，为一种较好的茶皂素提取原料;由图4为可知，仙居普通油茶和常山普通油茶茶蒲提取物多酚含量高于其他品种，大果红花油茶茶蒲提取物中多酚含量最低。

2.2 8种油茶蒲提取物抗氧化活性比较

2.2.1 DPPH 法测定结果

DPPH乙醇溶液呈紫色，是一种稳定的自由基，在波长517 nm处有强吸收。当溶液中存在有供氢能力的抗氧化剂时(如酚类)，其可与DPPH单电子配对，将溶液还原为浅黄色，吸光度变小，且其褪色程度与接受电子的数量呈正比，该方法被广泛用于评价植物提取物的体外抗氧化活性。

本试验测定了8种油茶蒲提取物对DPPH自由基清除能力，以抗坏血酸(VC)为阳性对照。由表1与图5可知8种油茶蒲提取物具有明显的清除DPPH自由基活性，且在一定范围内呈量效关系;其中仙居普通油茶茶蒲提取物清除能力最强，半抑制浓度仅为22.07μg/mL，其次为常山普通油茶;浙江红花油茶和大果红花油茶茶蒲提取物清除能力比较弱，整体来看普通油茶茶蒲提取物DPPH清除能力明显高于其他品种。

表1 八种油茶蒲提取物清除DPPH自由基半抑制浓度(IC50)

图5 油茶蒲提取物对DPPH清除作用

2.2.2 总抗氧化能力测定结果

FRAP工作原理如下:TPTZ中的Fe3+可被样品中还原物质还原为Fe2+，呈现出明显的蓝色，并于593 nm处具有最大吸收峰，由吸光度大小可计算样品抗氧化活性。以FeSO4浓度为横坐标(X，mmol/L)，吸光度为纵坐标(Y)，回归方程为Y=4.692 9X+0.015，R2=0.996 3。

FRAP值以测定样品液达到相同吸光度所需FeSO4毫摩尔数来表示，FRAP值越大，总抗氧化能力越强。由图6可知随着油茶蒲提取物浓度升高，FRAP值越大，总抗氧化能力越强，不同品种油茶蒲提取物抗氧能力依次为:仙居普通油茶＞常山普通油茶＞三江普通油茶＞攸县油茶＞小果油茶＞博白大果油茶＞大果油茶＞浙江红花油茶。在25μg/mL试样浓度下，抗坏血酸 FeSO4浓度为 0.338 2 mmol/L，仙居普通油茶茶蒲提取物总抗氧化能力最强，FeSO4浓度为0.187 2 mmol/L;浙江红花油茶和大果红花油茶茶蒲提取物总抗氧化能力最弱，FeSO4浓度分别为 0.066 8 mmol/L 和 0.069 7 mmol/L。总抗氧化能力测定结果和DPPH清除测定结果相似，普通油茶茶蒲提取物总抗氧化能力强于其他品种提取物。

图6 油茶蒲提取物总抗氧化能力测定

2.2.3 8种油茶蒲提取物活性物质与其抗氧化活性之间的相关性

DPPH法和FRAP法2种方法用来测定油茶蒲提取物抗氧化活性，DPPH方法是基于对DPPH自由基的清除作用来反映被测样品的抗氧化活性，半抑制浓度越低抗氧化活性越高;FRAP方法是基于体系中还原剂与三价铁离子的氧化还原反应，FRAP值(FeSO4当量)越大，被测样品抗氧化活性越强。由表2可知，油茶蒲提取物多酚物质与其抗氧化活性之间相关性最高，与FRAP值的相关性甚至达到了0.9;其次为多糖类物质，与DPPH清除率相关性为－0.829。据此，初步推测，油茶蒲提取物中多酚及多糖为其主要抗氧化物质，这两者含量越高，油茶蒲提取物抗氧化活性越强，测定结果与国内外文献报道［5，13，16］中油茶蒲多酚与多糖具有较强的抗氧化活性相一致。

表2 油茶蒲活性物质含量与其抗氧化活性之间的相关性

2.3 HPLC法分析测定8种油茶蒲提取物酚类物质特征化合物

多酚类物质例如槲皮素、芦丁、儿茶素、咖啡酸、没食子酸、绿原酸等具有较强的抗氧化活性［13］，运用反相－HPLC进一步分析测定油茶蒲多酚类物质成分及含量。参照文献［7］及对照标准品保留时间和最大吸收波长，确定没食子酸、MEAG及鞣花酸为油茶蒲酚类物质主要特征化合物，按照峰面积归一法测定这3种特征化合物含量。由图7与表3可知，不同品种油茶蒲提取物多酚类物质组成及含量差别较大，博白大果油茶茶蒲提取物中不含有这3种特征化合物，因其皂苷含量较高，分析图中特征峰物质可能为皂苷类，需要进一步分离鉴定;普通油茶茶蒲提取物中3种物质均含有，且以仙居普通油茶茶蒲含量最高，浙江红花油茶茶蒲提取物中没食子酸含量远远高于其他品种，而大果红花油茶茶蒲提取物中MEAG含量远远高于其他品种，因此可以利用大果红花油茶茶蒲提取物分离制备MEAG单体。除了这3种特征化合物外，由图7可知，还有很多特征峰物质组成成分并不明确，例如，浙江红花油茶在11 min左右出现的峰值，需要进一步分离鉴定，测定其生物活性。

表3 8种油茶蒲提取物酚类物质特征化合物含量测定

图7 不同品种油茶茶蒲提取物HPLC图

3 讨论与结论

油茶蒲是油茶加工过程中的副产物，含有大量木质素、多缩戊糖、皂素等化学成分［12］，其较强的抗氧化、抗癌、调节血脂等生物活性逐渐被人们认识发现，但对于其活性物质含量测定鲜有报道，本试验确定了测定油茶蒲提取物活性物质含量通用方法，测定结果表明油茶蒲提取物中皂苷类物质含量最高，其次为多糖类及酚类物质。

采用DPPH自由基清除法和总抗氧化能力法测定了油茶蒲提取物抗氧化能力，发现其具有较强的抗氧化活性，多酚类物质与抗氧化活性呈显著相关性(DPPH 清除，R2= －0.780;FRAP值，R2=0.911)，此测定结果与国内外文献报道呈一致性，例如，Zhang等［13］测定了产自广西、江西、湖南、浙江及安徽5个区域普通油茶茶蒲提取物总酚含量及抗氧化能力，结果表明广西地区茶蒲提取物总酚含量最高(没食子酸当量=234.90 mg/g)，抗氧化能力最强(DPPH清除IC50=899.25μg/mL，总抗氧化能力抗坏血酸当量=12.91 mg/g)，并且总酚含量与抗氧化能力之间存在显著相关性;Laura等［14］分析发现墨西哥山核桃皮提取物与其抗氧化活性之间有极显著地正相关性(ORAC，R2=0.945;DPPH，R2=0.999)，ORAC及DPPH清除作用与山核桃提取物中没食子酸含量呈正相关，与鞣花酸呈负相关，HO清除作用只与鞣花酸含量呈正相关，其他鞣酸物质含量呈负相关;杨冬梅等［15］分析了12种常见蔬菜多酚含量与其抗氧化之间关系，发现所有蔬菜抗氧化活性与多酚含量之间均有一定的相关性，FRAP值与多酚类物质之间的相关性最高(R2=0.808 6)。

通过分析活性物质含量与抗氧化活性之间相关性，发现油茶蒲多糖类物质与抗氧化活性之间也存在较为显著地相关性(DPPH清除，R2=－0.829)。Jin［5］将油茶蒲粗多糖经DEAE纤维柱层析和Sephadex G－200层析柱得到油茶蒲多糖(WEP2)，运用HPLC分析发现WEP2由鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，WEP2具有较强抗氧化活性，当质量浓度为1.0 mg/mL时，对羟基自由基和超氧阴离子自由基清除率分别达到72.5%和86.3%，强于同等浓度的抗坏血酸。

因此，初步推断油茶蒲提取物中多酚类物质与多糖类物质为其主要抗氧化物质。

Zhang等［13］运用HPLC分析测定了油茶蒲酚类物质组成，发现没食子酸为其主要成分。本试验采用HPLC法分析测定了不同品种油茶蒲提取物多酚类物质组成，发现不同品种之间酚类物质组成差别比较大，普通油茶和攸县油茶茶蒲提取物中酚类物质以没食子酸、MEAG和鞣花酸为主;而博白大果油茶茶蒲提取物中这3种都不含有，但是其清除DPPH能力和总抗氧化活性还比较强，因此一定还存其他酚酸类物质，需要进一步鉴定。通过系统研究不同品种油茶蒲提取物中活性物质及抗氧化活性，为有效地、针对性地利用油茶蒲资源提供了理论基础。

［1］彭阳生，奚如春.油茶栽培及茶籽油制取［M］.北京:金盾出版社，2006:33－34

［2］陈秋平，姜天甲，马晓丰，等.油茶蒲水提物的减肥作用［J］.中国粮油学报，2011，26(9):66 －69

［3］李远发，胡灵，王凌晖.油茶资源研究利用现状及其展望［J］.广西农业科学，2009，40(4):450 －454

［4］蒋应梯，陈顺伟，应晓伟，等.油茶壳用微波加热磷酸法制活性炭［J］.生物质化学工程，2011，45(2):34－36

［5］Jin X C.Bioactivities of water－ soluble polysaccharides from fruit shell of Camellia oleifera Abel:antitumor and antioxidant activities［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87(3):2198 －2201

［6］Chen QP，Luo X W，Ma X F，et al.Fatty acid synthase inhibitors separated from oiltea Camellia by high－speed countercurrent chromatography［J］.Journal of Food Science，2011，76(5):750－754

［7］陈秋平.油茶蒲减肥降脂功能因子研究［D］.杭州:浙江大学，2011

［8］罗晓伟.油茶蒲醇提取物抑制5α－还原酶及对前列腺疾病的作用［D］.杭州:浙江大学，2011

［9］罗晓伟，沈建福，肖仁显，等.油茶蒲提取物中次生代谢产物的测定［J］.食品工艺科技，2011，32(11):451 －453

［10］Zhou H C，Lin Y M，Wei SD，et al.Structural diversity and antioxidant activity of condensed tannins fractionated from mangosteen pericarp［J］.Food Chemistry，2011，129(4):1710－1720

［11］Zou Y P，Sam K C，Chang G Y，et al.Antioxidant activity and phenolic compositions of Lentil(Lens culinaris var.Morton)extract and its fractions［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(6):2268 －2276

［12］陈亚琪，康海权，陈秋平，等.油茶蒲提取物的抗氧化活性［J］.林业科学，2011，47(3):21 －24

［13］Zhang L L，Wang Y M，Wu D M，et al.Comparisons of antioxidant activity and total phenolics of Camellia oleifera A-bel fruit hull from different regions of China［J］.Journal of Medicinal Plants Research，2010，4(14):1407 －1413

［14］Laura A D，Emilio A P，Fereidoon S，et al.Phenolic compounds and antioxidant activity of kernels and shells of Mexican pecan(Carya illinoinensis)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(1):152 －162

［15］杨冬梅，金月亭，柯乐芹，等.12种常见蔬菜抗氧化活性的比较研究［J］.中国食品学报，2007，7(5):24 －29

［16］沈建福，康海权，陈亚琪，等.油茶果壳多糖的提取及抗氧化作用研究［J］.中国粮油学报，2010，25(8):51 －54.