回乳抑增一号对高泌乳素血症大鼠血清泌乳素水平和乳腺组织形态学的实验观察

王 雄， 陈永刚， 刘新国， 李居怡， 邹吉利， 吴金虎

(武汉市第三医院药学部，湖北武汉430060)

高泌乳素血症 (Hyperprolactinemia)，是一种常见的下丘脑-垂体-性腺轴疾患，是由于多种因素引起垂体前叶嗜酸性细胞分泌过多的泌乳素 (＞25 ng/mL)所致，大部分为女性发病，临床上以溢乳、闭经、月经稀少及不孕等症状常见［1］。高泌乳素血症的发生与体内泌乳素、雌激素、孕激素等水平异常有关，部分高泌乳素血症患者伴有乳腺增生症状。目前治疗高泌乳素血症的药物主要是进口药溴隐亭等，但其存在价格昂贵、副作用大等特点，患者依从性很差，很难坚持治疗。中医药在治疗高泌乳素血症方面具有很大的优势，尤其是中药复方治疗该病取得了满意的疗效［2］。回乳抑增一号是我院应用多年的院内制剂，由麦芽、牡蛎、浙川贝、夏枯草、白芥子、山慈姑、淡昆布、郁金、玄参、丹参等组成，具有回乳消胀、软坚散结等功效，治疗妇女溢乳，临床应用疗效显著。本研究采用大鼠高泌乳素血症模型，观察其对大鼠高泌乳素血症的治疗作用，探讨其作用机制，为其临床应用及新药开发提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 雌性未孕Wistar大鼠60只，体质量200～220 g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 仪器与试药 雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黄体生成素ELISA酶联免疫试剂盒 (上海丽臣生物有限公司，批号:08/2011)，恒温箱 (武汉大江电器仪表厂)，酶标仪 (深圳雷杜Rayto RT—6000)，全自动雷杜Rayto洗板机 (RT—3100)。

甲磺酸溴隐亭:Novartis Pharma Schweiz AG生产，批号:10080;盐酸甲氧氯普胺注射液 (徐州莱恩药业有限公司，批号:1006131)。回乳抑增一号处方组成:麦芽120 g、夏枯草20 g、玄参5 g、浙川贝10 g、郁金10 g、丹参10 g、白芥子8 g、淡昆布5 g、牡蛎10 g、山慈姑3 g，药材由湖北清大药业公司提供，经武汉市第三医院药学部吴金虎教授鉴定，各药材品种均符合2010版《中国药典》规定。复方制备方法:药材加8倍量的水浸泡60 min，用武火煮沸15 min，后用文火煮30 min，取煎液。药渣再用8倍量的水重复煎煮1次。两次煎液合并，滤过，浓缩至2.51 g/mL(每1 mL药液相当于2.51 g生药量)，4℃储存备用。

2 实验方法

2.1 模型制备 参考文献方法［3］并加以改进，在大鼠背部皮下按50 mg/kg体质量的剂量注射盐酸甲氧氯普胺注射液(灭吐灵)，每天9∶00和16∶00分别注射1次，连续5 d。

2.2 分组与给药 60只大鼠随机分为6组:正常组、模型组、溴隐亭阳性药组、回乳抑增一号低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，除正常组外，其他组别大鼠均制备成疾病模型，模型制备后给药。用药剂量根据人和动物体表面积与剂量换算［4］。阳性药组给溴隐亭，剂量为0.393 mg/(kg·d);回乳抑增一号高剂量组给予回乳抑增一号汤剂，剂量为33.1 g/(kg·d)(人临床剂量的11倍);回乳抑增一号中剂量组给予回乳抑增一号汤剂，剂量为16.55 g/(kg·d)(人临床剂量的5.5倍);回乳抑增一号低剂量组给予回乳抑增一号汤剂，剂量为8.28 g/(kg·d)(人临床剂量的2.75倍)。正常组和模型组给等容量的蒸馏水。各组动物在造模成功后，胃饲相应药物或蒸馏水，每日1次，每次2 mL，连续30 d。

2.3 样品采集 末次给药24 h后，所有动物禁食12 h，自由饮水。于次日上午8∶00～10∶00取血。取血方法为眼球摘除法:倒持固定大鼠，按住颈部，使眼球突出;以小止血钳迅速钳取眼球，眼眶内很快流出血液;同时作规律性松紧挤压胸腔，以促使血液流出;血液以3 000 r/min的速度离心5 min，取上清液供检测。

所有大鼠处死后，取第2对乳腺组织，用10%甲醛溶液充分固定24 h，标本取材后，放入生物组织自动脱水机内脱水，浸蜡后，在生物组织包埋机内包埋。每组组织蜡块在切片机上连续切片3张，切成4μm厚度。

2.4 样品检测

2.4.1 动物一般活动观察 观察正常组、造模组和各给药组大鼠的一般活动情况。

2.4.2 大鼠血清激素检测 采用酶联免疫分析方法检测各组大鼠血清中雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黄体生成素的水平，严格按照ELISA试剂盒说明书中实验操作流程进行。

2.4.3 大鼠乳腺组织形态学检查 大鼠乳腺组织经HE染色后，显微镜下观察各组大鼠乳腺组织情况，包括腺泡、小叶是否增生，导管形状及厚度，以及是否出现分泌物。

3 结果

3.1 对动物一般活动的影响 正常组大鼠饮食、饮水正常，粪粒正常，不带黏液;眼睛鲜红有精神，运动快速有力。造模后大鼠饮食、饮水量减少、大便稀;眼睛无神欲闭，精神萎靡，反应迟钝，行动迟缓，夜间自主活动减少。阳性药溴隐亭组大鼠治疗后，饮食、饮水有所改善，行动仍然迟缓。回乳抑增一号高、中剂量组大鼠饮食、饮水量佳、粪粒正常;毛发润泽、眼睛鲜红有精神，活动灵敏。回乳抑增一号低剂量组大鼠饮食、饮水量好转，精神不佳。

3.2 对大鼠血清激素水平的影响 由表1可见，与正常组比较，模型组大鼠血清泌乳素水平明显升高 (P＜0.05)，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黄体生成素值明显下降(P＜0.05)。与疾病模型组相比，回乳抑增一号高剂量组和中剂量组大鼠血清泌乳素水平明显下降，有显著差异(P＜0.05)，且高剂量组接近正常组水平，疗效与溴隐亭相当。回乳抑增一号中剂量组与模型组相比，雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黄体生成素水平显著提高，均接近正常组水平，治疗效果最好。回乳抑增一号低剂量组无明显效果。

3.3 对大鼠乳腺组织病理形态的影响 乳腺增生根据病理增生状况分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 5个等级［5］，分级标准见表2。

显微镜下观察可见，正常组大鼠乳腺小叶不增生，腺体数量极少，腺泡和导管无增生、扩张，无分泌物，处于静止状态 (见图1A);高泌乳素血症模型大鼠均发现乳腺小叶部分增生，个别腺泡和导管轻度增生，存在少量分泌物，出现轻度乳腺增生 (Ⅰ级或Ⅱ级增生)(见图1B和1C);溴隐亭阳性药组大鼠乳腺腺泡及小叶部分增生，导管扩张，可见分枝，腔内有少许分泌物 (见图1D);回乳抑增一号高、中剂量组大鼠乳腺腺泡恢复正常，分布均匀，大多数导管细长，分枝少，无分泌物 (见图1E和1F);回乳抑增一号低剂量组大鼠乳腺小叶部分增生个别腺泡和导管轻度增生，存在分泌物 (见图1G)。

表1 回乳抑增一号对高泌乳素血症大鼠雌二醇、孕酮、泌乳素、促卵泡激素、促黄体生成素水平的影响 (n=10)

表2 乳腺组织病理增生状况分级

图1 各组大鼠乳腺组织病理形态图 (HE×200)

对每只大鼠的乳腺增生状况按表2标准进行分级，结果经Ridit检验，阳性药溴隐亭组、回乳抑增一号高和中剂量组与模型组比较有显著性差异 (P＜0.05)，有明显的治疗作用，见表3。

表3 回乳抑增一号对高泌乳素血症大鼠乳腺组织病理形态的影响

4 讨论

目前，制备高泌乳素血症的动物模型方法的报道很多，如灌胃己烯雌酚片［6］、灭吐灵腹腔注射模型［7］、异体垂体前叶植入模型［8］、氟哌啶醇皮下注射模型［9］、灭吐灵皮下注射模型［10］等。灭吐灵能阻断下丘脑多巴胺受体，抑制催乳素抑制因子，促进泌乳素的分泌。己烯雌酚作为雌性激素类避孕药，也是一种多巴胺受体拮抗剂类药物。本实验对造模方法进行了重复和摸索，发现灭吐灵腹腔注射的方法重复率不高，个体差异大;灌胃己烯雌酚片的方法所需周期长;异体垂体前叶植入模型的方法过于复杂，难度较大。最终，发现皮下注射灭吐灵造模，具有造模时间短、操作简便、成功率高等优点。所选造模动物种类也很多，主要有大鼠、小鼠、兔等，以大鼠最为常用。故采用大鼠背部皮下注射灭吐灵的方法制备高泌乳素血症模型，实验证实其造模时间短，成功率高。

高泌乳素血症属中医的“闭经”、 “乳泣”、 “月经过少”、“不孕”等范畴，常见病因为肝郁气滞或肝郁化火、肝火上升;或肾虚肝郁或肝肾不足致冲任失养，封藏失职;或脾虚痰阻，统摄无权，气血紊乱［11］。现代医学诊断高泌乳素血症主要根据血清激素的检测，泌乳素＞25 ng/mL、雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黄体生成素的降低为其特异性指标。血清泌乳素浓度的增高会扰乱下丘脑-垂体-性腺轴的功能，使下丘脑促性腺激素释放激素 (GnRH)合成和分泌受阻，并减弱了垂体对GnRH的敏感性，导致促卵泡激素分泌低下，进而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡发育不良和黄体功能不足而致月经失调、闭经和不孕等［12］。同时，通过实验研究发现，高泌乳素血症大鼠均出现轻度乳腺增生，乳腺小叶部分增生，个别腺泡和导管轻度增生，存在少量分泌物等。这和临床上报道的部分高泌乳素血症患者伴有乳腺增生症状相一致，说明高泌乳素血症和乳腺增生密切相关，泌乳素的升高可促进乳腺增生的发生。目前科学界主要认为乳腺增生的发生与雌二醇和孕酮有直接的关系［13］，而忽视了泌乳素对乳腺增生的影响。近年来越来越多的文献报道泌乳素对乳腺增生的作用，所以今后在临床中应该增加对泌乳素的检测，重视泌乳素与乳腺增生的关系，有助于深入研究乳腺增生的发病机制。

中药复方能调节机体内分泌平衡，在治疗高泌乳素血症方面优势突出。回乳抑增一号方中重用生麦芽以回乳消胀，夏枯草入肝经能消肿散结同为君药;佐以玄参、浙贝母清热散结，以助夏枯草散结之功，郁金能活血行气而开郁止痛，丹参善活血散结调经止痛，共助麦芽疏肝消胀，四味同为臣药。白芥子利气散结通络止痛，昆布消痰散结，牡蛎软坚散结，山慈菇解毒消痈散结，俱为佐药。全方配伍，回乳、散结、疏肝、止痛之法具备，直达肝经，共奏回乳消胀，软坚散结，化痰通络，行气活血之功效。现代科学研究发现［10］，麦芽中含有类似溴隐亭样物质，具有拟多巴胺激动剂的作用，其水提物治疗高泌乳素血症效果显著。

回乳抑增一号能显著降低高泌乳素血症患者过高的泌乳素，调节机体下丘脑-垂体-性腺轴的平衡，改善卵巢功能，恢复卵泡和黄体功能，恢复雌二醇、孕酮、促卵泡激素和促黄体生成素的正常水平，达到治愈由高泌乳素血症引起的溢乳、月经失调、闭经和不孕等疾病的目的。同时，其也能显著改善高泌乳素血症引起的乳腺增生症状。从实验结果看，其疗效确切，与溴隐亭有相似疗效，且无毒副作用，为中医临床应用提供了实验依据。不过，今后的研究还要侧重于回乳抑增一号治疗高泌乳素血症的组方优化研究，因方中药味较多，以及使用药量很大，如何优化配伍使其疗效达到最佳，是下一步的工作目标。

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