PTEN基因在正常核型AML中的表达

冯安华，王占聚，刁琳琳，刘永，陈国霞

(1.潍坊医学院;2.潍坊市临朐县五井中心卫生院，山东潍坊261042)

PTEN基因定位于染色体10q23.3，是具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，与多种实体瘤的发生密切相关。近年来多项研究表明该基因的异常表达与血液系统肿瘤如白血病的发病、发展及预后有重要关系，本文采用逆转录聚合酶链反应 (RT－PCR)及免疫印迹杂交方法 (Western blot)，主要研究该基因在正常核型AML中的表达及临床意义。

1 方法与资料

1.1 一般资料

收集潍坊医学院附属医院2011年6月至2012年10月期间住院及门诊随访的AML患者，从中筛选出表达正常核型 (根据《人类细胞遗传学国际命名体制 (ISCN 1995)》判定)的AML患者共15例 (其中初诊病人8例，复诊病人7例)，FAB亚型为M0者1例，M1者1例，M2者5例，M3者1例，M4者2例，M5者4例，M6者1例，男6例，女9例，中位年龄35(7～58)岁。诊断标准:参照《血液病诊断及疗效标准》 (2007年，张之南主编)。15例AML病人 (M3首选全反式维甲酸+DA方案)采用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)及IA(去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)等方案诱导化疗。选取15例正常人BM设立对照组，其中男7例，女8例，中位年龄36(25～52)岁。

1.2 取材

1.2.1 有核细胞RNA的提取 分别于确诊后化疗前、完全缓解后抽取患者2～5 mL骨髓或外周血置于抗凝管中制成悬液，加入等体积淋巴细胞分离液中离心，吸出单个核细胞 (MNC)，洗涤2次。采用TRIzon RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度，RNA浓度 (ug/mL)=OD260×稀释倍数×40。

1.2.2 cDNA的合成 将RNase Free dH2O 9.5μL，5×RT buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dT)201μL，总RNA模板2μL，ReverTra Ace 1μL反应体系于30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min条件下反转录，反应结束后冰浴5 min，所得cDNA于－20℃保存。

1.2.3 引物设计与合成 采用Oligo6.0软件设计引物。由北京康为世纪生物科技有限公司合成。

1.2.4 PCR及结果检测 于PCR板中加入20μL反应体系，包括cDNA 2μL，上下游引物各1μL，dNTP1.5μL，MgCl22μL，5×buffer 2μL，ddH2O 10μL，Taq酶0.5μL。扩增条件:预变性 (94℃，1 min)、变性 (94℃，1 min)、退火 (58℃，30 s)、延伸 (72℃，1 min)，进行40个循环，72℃10 min后离心，－20℃保存。将10μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳1 h，紫外灯检测。

1.2.5 总蛋白提取及蛋白浓度测定 按每107个MNC细胞加1 mL预冷的Lysis buffer(1 mL Lysis buffer+5μL磷酸酶抑制剂+1μL蛋白酶抑制剂+5μL 100 mmol/LPMSF)，将洗涤细胞加到预冷离心管中，提取细胞总蛋白。按试剂盒说明 (上海生工生物工程有限公司)于96孔标准板上加样操作，60℃30 min，测定562 nm光密度 (OD)值，利用标准曲线计算蛋白浓度，－80℃保存备用。

1.2.6 Western blot检测 将80μg样品蛋白质与等体积缓冲液混匀，经5%浓缩胶和10%SDSPAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，加1:1 000的兔抗人单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBS/Tween洗膜5 min×3次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，TBS/Tween洗膜5 min×3次。化学发光法检测后分析结果。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，定量资料用均数±标准差表示，采用F检验和q检验进行多组均数间的比较;计数资料采用¯x±s检验。

2 结 果

PTEN mRNA在AML组阳性表达水平低于正常对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05);初诊/复治AML组mRNA阳性表达水平低于完全缓解AML组，差异有统计学意义(P＜0.05)。AML组PTEN蛋白阳性表达水平低于正常对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05);初诊/复治的AML组PTEN蛋白阳性表达水平低于完全缓解的AML组，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 各组PTEN基因及蛋白表达比较

3 讨 论

PTEN是同时具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性的抑癌基因，通过下调PI3P/AKT信号转导［1］，抑制肿瘤细胞增殖和侵袭;通过降低FAK的酪氨酸磷酸化水平，促进细胞凋亡，抑制细胞的增殖。多种研究发现，在AML中PTEN基因可能通过碱基突变、缺失、启动子区域甲基化等在基因水平上的异常及翻译过程或者蛋白水平等多种异常机制失活［1－2］。有报道在蛋白水平 NF－kB下调 PTEN表达，而抑制其促凋亡效应［3］。本研究发现，在排除异常核型干扰的情况下，初发/复发AML患者细胞中存在PTEN基因及蛋白的低表达，在达到完全缓解后，阳性表达率及表达水平均有所提高，且PTEN基因及蛋白的阳性表达无正相关关系，说明在正常核型AML中PTEN基因完全缺失少见。另外，在正常核型AML患者BM细胞中，部分PTEN mRNA 的表达可能来自正常细胞［2］1086－1090。

PTEN基因及蛋白的异常表达参与了白血病化疗过程中多药耐药机制的产生。近年来靶向治疗如雷帕霉素［4］等药物的研究为白血病的治疗提供了新的靶点。有学者认为［5－6］，PTEN表达与否对于区分正常造血干细胞和白血病干细胞具有重要作用。PTEN基因及蛋白的低表达与预后不良可能相关，有待进一步论证。

［1］ Dahia P，Aguiar R，AlbertaJ.PTEN is inversely correlated with the cells urvival fact or Akt/PKB and is inactivated via multiplem echanisms in haematological malignancies［J］ .Oxford:Oxford University Press，1999:185－193．

［2］ 邹兴立，刘霆.抑癌基因pten在骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的表达［A］.北京:《中国实验血液学杂志》编辑部，2008:1086－1090．

［3］ Vasudevan KM，Gurumurthy S，Rangnekar VM.Suppression of PTEN expression by NF－kappaB prevents apoptosis［J］．Poitiers:C.M.B.Association，2004:1007－1021．

［4］ 成志勇，杨晓阳.PTEN对 K562细胞mTOR调控的研究［A］.上海:《肿瘤》杂志编辑部，2009:139－144．

［5］ Yilmaz OH，Valdez R，TheisenBK，et al．Pten dependence dist inguishes haematopoietic stem cells from leukaemiain itiating cells［J］．London:Nature Publishing Group，2006:475 －482．

［6］ Zhang J，Grindley JC，Y in T，et al．PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention［J］．London:Nature Publishing Group，2006:518－522．