环草石斛化学成分研究*

李春燕，陆 羽，陈 烨，郑嘉雯，王 军

(中山大学药学院，广东广州 510006)

兰科石斛属Dendrobium SW.植物全世界约有1 100种，我国境内有76种，其中有近40种被作为药用［1］，用于治疗胃阴不足，病后虚热不退，目暗不明等症［2］。在治疗糖尿病及老年性疾病的方剂中，石斛常是主要成分［3－5］。由于石斛的药效及广泛用途，成为药用植物的研究热点，得到国内外学者的关注［6］。

环草石斛也叫小环钗石斛、美花石斛、粉花石斛，主要分布于贵州、广西、云南和广东等省，被2000版中国药典收载。因金钗石斛，铁皮石斛等价格昂贵，中医临床所使用的石斛多是环草石斛或黄草石斛。关于环草石斛的化学成分研究较少，李满飞等［7］从环草石斛的HCl(φ=1%)浸提液中分离到了有抑制大鼠肾脏微粒体活性的石斛宁生物碱;秦海林等［8］部分归属了环草石斛特征性标准提取物 (SCE)乙醚萃取部位的1H NMR指纹图谱;Ito等［9］研究了环草石斛φ=80%醇提液的化学组成，找到了具清除自由基活性及NO生成抑制活性的新结构芪类。

我们在研究中药药效成分的工作中发现，约有50%的环草石斛醇取物分配在大极性的正丁醇萃取部位，而已报道的关于环草石斛化学成分的研究大都集中在石油醚、乙酸乙酯等中小极性萃取部位。为了阐明环草石斛的药效物质基础，本研究对环草石斛甲醇提取液进行了系统的化学成分研究，利用现代色谱技术和波谱技术分离鉴定了7个化合物，分别是:石斛宁 (1)，2，4，7－三羟基－9，10－二氢菲 (2)，moscatin(3)，loddigesiinols C(4)，杓唇石斛酚 (5)，石斛酚 (6)，tristin(7)，其结构见图1。其中化合物2和7为首次在环草石斛中分离得到，对环草石斛的药效成分进行了初步探讨。

图1 分自环草石斛的化合物分子结构Fig.1 Structures of compounds from Dendrobium loddigesii

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

实验试剂:石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、丙酮等为分析纯试剂，氘代试剂为美国CIL产品;TLC硅胶 (GF254)和柱层析硅胶 (200～300目)均为青岛海洋化工有限公司产品，Sephadex LH－20凝胶为美国GE Healthcare产品，反相硅胶ODS－A为日本Daiso公司产品。环草石斛 (茎)D.loddigesiiRolfe于2011年9月购自广州采芝林药店，该药材产自云南，广州市药材公司中药饮片厂监制，由中山大学药学院蒋林研究员鉴定。

实验仪器:日本岛津LC－20AT中压液相制备色谱，Bruker AvanceШ 400 MHz核磁共振谱仪，LCQ DECA XP型液相色谱－质谱联用仪，美国Perkin Eimer TM公司Perkin Eimer 341型比旋光测定仪。

1.2 提取与分离

环草石斛 (茎)4 kg，甲醇冷浸 (35 L ×2)，减压浓缩提取液得浸膏100 g。将浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取 (3 L×3)，减压浓缩萃取液，分别得石油醚萃取浸膏13 g，氯仿萃取浸膏25 g，乙酸乙酯萃取浸膏10 g，正丁醇萃取浸膏47 g，水溶层浸膏16 g。

氯仿萃取浸膏经Sephadex LH－20凝胶柱层析，甲醇洗脱，脱去叶绿素后，用硅胶 (200～300目)柱色谱分离，以石油醚－乙酸乙酯 (体积比为 100∶0、90∶1 、80∶20 、70∶30 、50∶50、40∶60、10∶90和0∶100)混合溶剂梯度洗脱，得到8个馏分 (Fr.L1～8)。Fr.L5～6合并 (6 g)，经中压液相色谱系统分离，固定相为ODS反相键合硅胶，水－甲醇混合溶剂梯度洗脱，分段收集，在V(水)∶V(甲醇)=50∶50段得化合物 5，V(水)∶V(甲醇)=45∶55段分别得化合物6、化合物4，V(水)∶V(甲醇)=40∶60段得化合物3，各馏份分别进一步经Sephadex LH－20凝胶柱色谱纯化，甲醇洗脱，得到相应的纯化合物。Fr.L 7与乙酸乙酯萃取部位合并，用硅胶 (200～300目)柱色谱分离，以石油醚－乙酸乙酯 (体积比为100∶0、90∶1 、80∶20，70∶30 、50∶50、30∶70、20∶80和0∶100)混合溶剂梯度洗脱，得到8个馏分 (Fr.Y1～8)。Fr.Y6～7合并(3 g)，经中压液相色谱系统纯化，固定相为ODS反相键合硅胶，以水－甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集V(水)∶V(甲醇)=70∶30段馏份，得化合物2，继续收集V(水)∶V(甲醇)=60∶40段馏份得化合物7，各段馏份分别再经Sephadex LH－20凝胶柱色谱多次纯化，甲醇洗脱，得相应的纯化合物。正丁醇萃取浸膏，经Sephadex LH－20凝胶柱色谱除糖，甲醇洗脱，再经正相硅胶柱色谱分离，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=25∶1混合溶剂等度洗脱，得到化合物1。

2 结构鉴定

化合物1，淡黄色油状液体，易溶于乙酸乙酯、甲醇等。ESI－MSm/z:204.3［M+H］，分子式 C12H13NO2，不饱和度为 7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.87(1H，d，7.2 Hz)，7.71(1H，t，7.2 Hz)，7.57(1H，t，7.2 Hz)，7.47(1H，d，7.2 Hz)，3.39(1H，m)，3.07(1H，m)，2.46(1H，m)，2.38(1H，m)，2.14(2H，m)，2.13(3H，s)，与文献 ［10］对照，鉴定化合物1为石斛宁。

化合物2，白色片状结晶，易溶于丙酮。ESI－MSm/z:227.3［M－H］，分子式C14H12O3，不饱和度为 9。1H NMR(400 MHz，aceton－d6)δ:8.25(1H，d，8 Hz)，6.74(1H，dd，1.2，8 Hz)，6.73(1H，d，1.2 Hz)，6.44(1H，d，1.2 Hz)，6.34(1H，d，1.2 Hz)，2.63(4H，s)，与文献［11］对照，鉴定化合物2为2，4，7－三羟基－9，10－二氢菲。

化合物3，白色粉末状结晶，易溶于丙酮。ESI-MSm/z:239.2［M －H］，分子式 C15H12O3，不饱和度为 10。1H NMR(400 MHz，aceton-d6)δ:7.63(1H，d，8.8 Hz)，7.50(1H，d，8.8 Hz)，7.44(1H，t，8.8 Hz)，7.40(1H，dd，8.8，1.6 Hz)，7.14(1H，dd，8.8，1.6 Hz)，7.10(1H，d，1.6 Hz)，7.02(1H，d，1.6 Hz)，4.15(3H，s)。与文献 ［12］对照，鉴定化合物3为moscatin。

化合物4，无定形白色固体，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:333.1［M－H］，分子式C18H22O6，不饱和度为8。 ［α］27D－0.6°(c=1.0，MeOH)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.78(1H，d，7.8 Hz)，6.59(1H，dd，7.8，1.5 Hz)，6.49(1H，d，1.5 Hz)，6.41(2H，s)，4.17(1H，t，6.6 Hz)，3.82(6H，s)，3.76(3H，s)，3.20(3H，s)，3.02(1H，dd，6.9，13.3 Hz)，2.76(1H，dd，6，13.6 Hz)。与文献 ［9］对照，鉴定化合物4为loddigesiinols C。

化合物5，白色针状结晶，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:305.1［M+H］，分子式C17H20O5，不 饱 和 度 为 8。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.81(1H，d，8 Hz)，6.66(1H，dd，1.6，8 Hz)，6.59(1H，dd，1.6 Hz)，6.34(2H，s)，3.82(6H，s)，3.81(3H，s)，2.79(4H，s)。与文献［8］对照，鉴定化合物5为杓唇石斛酚。

化合物6，淡黄色油状物，易溶于氯仿、丙酮、甲醇等。ESI-MSm/z:273.2［M－H］，分子式 C16H18O4，不饱和度为 8。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.81(1H，d，8 Hz)，6.65(1H，dd，8，1.6 Hz)，6.60(1H，d，1.6 Hz)，6.29(1H，d，1.6 Hz)，6.23(2H，d，1.6 Hz)，3.82(3H，s)，3.72(3H，s)，2.78(4H，s)。与文献 ［8］对照，鉴定化合物6为gigantol。

化合物7，无色针状结晶，易溶于丙酮。ESIMSm/z:259.2［M－H］，分子式C15H16O4，不饱和度为 8。1H NMR(400 MHz，aceton-d6)δ:6.79(1H，d，1.6 Hz)，6.70(1H，d，8 Hz)，6.61(1H，dd，1.6，8 Hz)，6.21(2H，d，1.6 Hz)，6.19(1H，d，1.6 Hz)，3.79(3H，s)，2.75(4H，m)。与文献［13］对照，鉴定化合物7为tristin。

3 结果与讨论

研究对环草石斛的甲醇提取物进行了较系统的分离，单离到6个多酚和1个生物碱 (化合物结构式见图1)，化合物1，2，3，4，5，6，7(w/%)分 别 为 0.062，0.010，0.001，0.001，0.025，0.001，0.003，其中化合物2和7为首次在环草石斛中发现的芪类化合物。

本研究从环草石斛的正丁醇萃取部位单离到大量的石斛宁生物碱，从4 kg药材中分到2.5 g多纯品 (纯度为99%);进一步用1H NMR技术研究环草石斛正丁醇萃取物，结果显示，低场δ 8.5～7.5有强的石斛宁及类似结构化合物的共振信号 (见图2)，可推出石斛宁或类似结构的生物碱为环草石斛的主要化学成分，故环草石斛属含生物碱较多的优质石斛药材［14］;环草石斛中等极性部位的化学成份主要是联苄、9，10－二氢菲、菲等多酚类物质，5在其中含量最多，其次是化合物2。

图2 环草石斛正丁醇萃取部位1H NMR谱(400 MHz，Methanol-d4)Fig.2 1H NMR spectrum of the extract from Dendrobium loddigesii with n-BuOH

石斛宁目前只在兰科植物中发现，对兰科植物的化学分类学有重要意义［15］。已有研究报道石斛宁能抑制大鼠肾脏微粒体Na-K-ATP酶［8］，这一药理活性与石斛在中医临床上滋阴清热的功效是相吻合的，因此石斛宁可被认为是石斛滋阴清热的药效成分之一。芪类化合物具有广泛的抗血小板聚集、抗炎、抗肿瘤、抗畸变、抗氧化、细胞凋亡等活性［16－18］，这些结构多样性的芪类化合物，与中医认为石斛具有抗衰老功效相吻合。

4 结论

本研究得出环草石斛中生物碱和芪类化合物的含量非常丰富，且有较多的结构多样性。深入研究环草石斛的活性成分，可为阐明其成份－药效的关系提供科学依据，也可为石斛所制成的中成药质量控制提供依据。

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