太行山区柴胡中总皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量测定

李 竞 高 英 李海龙 李卫民 周海平 孔增科

1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；2.河北省邯郸市卫生局，河北邯郸 056000；3.河北省邯郸市食品药品检验中心，河北邯郸 056000

柴胡，原名茈胡，为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”[1]。北柴胡主产于河北、河南、陕西等地，南柴胡主产于吉林、江苏、安徽等地。《中国植物志》记载[2]，我国有柴胡属植物36 种、17个变种、7个变型，具有疏散退热，舒肝解郁，升举阳气之功能，为中医治疗少阳症的首选要药，是河北道地药材之一[3-5]。

柴胡化学成分复杂，主要含有皂苷、黄酮、挥发油、有机酸、多糖类等[6-8]。药理研究表明，柴胡具有解热、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗肿瘤等作用[9-11]。由于药品流通市场柴胡使用品种混乱，且采收时间跨度较长，所以不同来源的柴胡所含皂苷类成分含量差异较大。本文建立了紫外分光光度法测定柴胡中总皂苷及HPLC 法测定柴胡皂苷a、d的方法，对13 批采自太行山区的柴胡样品进行定量分析，为评价太行山区柴胡质量优劣提供数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Sartorius BS 110S 精密天平；KQ5200DE 型数控超声波清理器；RE-2000 旋转蒸发器；UVmini-1240 紫外分光光度计；岛津LC-10AT vp Plus 高效液相色谱仪，包括：二元泵，柱温箱；Phenomenex 预柱。

1.2 试剂与材料

柴胡皂苷a 对照品 （成都曼斯特生物科技有限公司，批号：11052402），柴胡皂苷d 对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：12020301）；德国Merck 公司色谱乙腈；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材来源

柴胡药材由人工在河北、河南、山西当地采集，经广州中医药大学张丹雁教授鉴定为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根。对13 批柴胡样品进行总皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量测定。产地及来源见表1。

表1 柴胡样品来源

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1 检测波长的选择 参考相关文献[12]，精密吸取供试品溶液与对照品溶液各0.2 mL，加入1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，70℃温热10 min，取出放冷，加入磷酸4.0 mL，70℃反应 30 min，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录ⅤA）于400～800 nm 范围内进行全波长扫描（图1）。结果在545 nm 左右有最大吸收峰，故确定检测波长为545 nm。因柴胡药材中柴胡皂苷d 含量大于柴胡皂苷a 含量，故以柴胡皂苷d 作为研究指标进行总皂苷含量的测定。

2.1.2 供试品溶液的制备 取柴胡样品和对照药材粉末（过四号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入5%浓氨水试液的甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水温超声处理30 min，滤过，用甲醇分2 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加少量水溶解，再用饱和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗涤2 次，每次20 mL，弃去水液，回收正丁醇至干，甲醇溶解，并定容至5 mL，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷d 适量，加甲醇制成每毫升含0.814 mg 的溶液，即得。

图1 柴胡皂苷d 和样品经显色后的紫外扫描

2.1.4 标准曲线的制备[12]分别精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至1 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取对照品溶液各0.2 mL，分别加入1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，70℃温热10 min，取出放冷，加入磷酸4.0 mL，70℃反应30 min，放冷，在波长 545 nm处分别测定吸光度值。以柴胡皂苷d 质量为横坐标（x），吸光度值为纵坐标（y），绘制标准曲线，得回归方程为：y=6.441 0x－0.022 5，r=0.996 9。结果显示，柴胡皂苷 d 在0.032 56～0.162 80 mg 范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度实验 取同一份的柴胡皂苷d 溶液，按“标准曲线的制备”操作，重复测定5 次，吸光度平均值为0.459，RSD 为1.51%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性实验 取11 号样品制成的供试品溶液，按“标准曲线的制备”操作，分别于配制后 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h进行测定，测定吸光度平均值为0.656，RSD 为1.16%，表明本品在2.5 h 内具有良好的稳定性。

2.1.7 重复性实验 取11 号样品，平行6 份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液和“2.1.4”项下方法操作，测定吸光度平均值为0.635，RSD 为2.06%，表明本法具有良好的重现性。

2.1.8 加样回收率实验 精密称定已知含量的11 号样品6 份，分别精密加入一定量的柴胡皂苷d 溶液，按“2.1.2”项下制备供试品溶液和“2.1.4”项下方法操作，测得平均加样回收率为99.73%，RSD 为2.07%，表明总皂苷回收率良好。结果见表2。

表2 总皂苷含量测定加样回收率实验结果

2.1.9 13 批样品中总皂苷的含量测定分别取13 批样品粉末（过四号筛），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1.4”项下方法操作，记录吸光度值，并计算样品中总皂苷的含量，结果见表3。

表3 13批样品中总皂苷及柴胡皂苷a、d的含量测定结果（%）

2.2 柴胡皂苷a、d 的含量测定[1]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；梯度洗脱：0～50 min：25%～90%（A）；50～55 min：90%（A）。在此色谱条件下，样品分离良好。见图2。

图2 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和柴胡样品高效液相色谱图

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液 25 mL，密塞，30℃水温超声处理 30 min，滤过，用甲醇20 mL 分2 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a 1.29 mg，柴胡皂苷d 1.19 mg，分别置5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 线性关系考察分别精密吸取柴胡皂苷a、d 对照品溶液 0.1，0.25，0.5，0.75，1 mL，分别加甲醇定容至刻度，摇匀。按“2.2.1”项下色谱条件进样10 μL 进行测定，记录峰面积值。以柴胡皂苷a、d 的进样量X（μg）为横坐标，峰面积值Y 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：柴胡皂苷a：Y=142 840X－6110.6，r=0.999 6，柴胡皂苷 a 在 0.258～2.580 μg 范围内线性关系良好；柴胡皂苷d：Y=170 759X－1 637.5，r=0.999 7，柴胡皂苷 d 在 0.238～2.380 μg 范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 精密吸取柴胡皂苷d 对照品溶液10 μL，重复进样5 次，测定峰面积平均值为400 858.8，柴胡皂苷d的RSD 为1.64%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 精密称取11 号样品制成的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件操作，分别于 0、2、4、6、12、24 h进样测定，结果表明，柴胡皂苷a 的RSD 为1.82%，柴胡皂苷d 的RSD 为1.58%，表明本品24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性实验 精密称取11 号样品6 份，分别按“2.2.2”项下制备供试品溶液，依“2.2.1”项下色谱条件操作，结果表明，柴胡皂苷a 的RSD 为1.18%，柴胡皂苷d 的RSD 为1.03%，表明方法重现性良好。

2.2.8 回收率实验 精密称定已知含量的11 号样品6 份，分别精密加入一定量的柴胡皂苷a、d 对照品溶液，分别按“2.2.2”项下制备供试品溶液，依“2.2.1”项下色谱条件操作，计算回收率，柴胡皂苷a 的平均回收率为100.40%，RSD 为1.72%；柴胡皂苷d 的平均回收率为99.70%，RSD为1.50%。

2.2.9 13 批样品中柴胡皂苷a、d 的含量测定分别取13批样品粉末（过四号筛），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录柴胡皂苷a、d的峰面积，并计算其含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 总皂苷含量测定方法的选择

比较香草醛-高氯酸显色法[13-15]和对二甲氨基苯甲醛-磷酸显色法发现，香草醛-高氯酸显色法下供试品与对照品在相同波长下没有共同吸收峰，而对二甲氨基苯甲醛-磷酸显色法下供试品与对照品在相同波长（545 nm）下有共同吸收峰，且吸光度值正常，故选择对二甲氨基苯甲醛-磷酸显色法。

3.2 含量测定

太行山区不同采收时间的柴胡样品中总皂苷及柴胡皂苷a、d 的含量相差比较大，柴胡皂苷a、d 高者，总皂苷不一定高，反之亦然。由实验结果看出，5 号和6 号样品中总皂苷及柴胡皂苷a、d 三者含量均很低，低于《中国药典》2010年版规定 “柴胡中柴胡皂苷a 和d 的总量不得少于0.30%”，因此，其药用价值值得商榷[16]。10 号样品中柴胡皂苷柴胡皂苷a 和d 的总量为0.34%，总皂苷含量达到1.14%；而13 号样品总皂苷含量为0.87%，柴胡皂苷a 和d的总量达到0.71%。所以，应综合考察柴胡皂苷a、d 及总皂苷三者的含量来评价柴胡的质量，只有三者均高才是质量最佳。

本实验采用高效液相色谱法和紫外分光光度法对柴胡中柴胡皂苷a、d 和总皂苷的含量进行测定，建立了各自的测定方法，其方法稳定可靠、简便易行快速，结果准确。不过，本研究仅对采自太行山区的13批柴胡样品进行含量测定研究，所用样品数量有限，后期拟将对不同来源以及不同采收季节的柴胡样品进行广泛的研究，为进一步考察太行山区的柴胡质量提供依据。

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