鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究

杨成明 滕 利 黄谙飞

1.广东省深圳市南山区西丽人民医院眼科，广东深圳 518055；2.广东省深圳市南山区西丽人民医院病理科，广东深圳 518055

角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘外围区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新型的报告基因，用GFP作为标志物来标记ES细胞，可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞，并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化，为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸，购自Sigma公司；丝裂霉素C，购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine 2000、G418，均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子 （1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1，购自Clontech公司；明胶、TaqDNA聚合酶，购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 ES细胞的培养 ES 细胞复苏后，经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养，加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM （内含0.1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺、150 mL/L 胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d传代1次。

1.2.2 转染及诱导ES细胞 将真核细胞表达载体pEGFPN1转染ES细胞作为实验组，空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合，加入ES细胞培养皿中，置37℃的CO2培养箱中培养，换液，培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆，接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，继续扩增培养，获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞，接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，加入无LIF的ES细胞培养液，隔日换液，传3～4代，诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。

1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定 显微镜下观察ES细胞形态，诱导培养7 d后，细胞基本融合，将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭30 min，滴加K14、K12及CD44单抗，4℃过夜，0.02%Triton-PBS洗涤，加人生物素标记的二抗，室温下孵育40 min，PBS洗涤数次后，加入链亲和素一过氧化物酶溶液，放置于室温下10 min，0.02%Triton-PBS洗涤，最后DAB显色，显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR检测 Trizol R试剂盒提取ES细胞总RNA，具体过程参照Trizol Reagent说明书。引物序列分别为：CD44正义链5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反义链5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）；K12 正义链 5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反义链 5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14 正义链 5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反义链 5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；内参照 β-actin正义链 5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反义链 5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每个周期参数如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30个循环周期。采用小鼠角膜上皮细胞做阳性对照，每组PCR反应均设一个阴性对照。取RT-PCR产物20 μL行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察结果，凝胶成像系统拍照。

2 结果

2.1 ES细胞的形态

在饲养层上培养的ES细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。GFP阳性ES细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内有微弱的绿色荧光（图1～2）。

2.2 诱导分化的角膜上皮细胞形态

GFP阳性ES细胞经Ⅳ型胶原诱导培养1周，可见在细胞集落中爬出上皮样细胞，贴壁生长，增殖迅速，逐渐呈集落式生长，生长胞体多为扁平，呈多角型或不规则形态生长，表现出典型的上皮细胞形态，在荧光显微镜下可观察到细胞内有很强的绿色荧光（图3～4）。

2.3 K12、K14及CD44表达情况

图1 光镜下的ES细胞（×100）

图2 荧光显微镜下GFP未转染的ES 细胞（×100）

图3 诱导后的角膜上皮样细胞（×100）

图4 GFP转染后诱导的角膜上皮样细胞（×100）

RT-PCR检测发现：诱导分化的ES细胞中有K12及CD44表达，而K14则无表达，证实转染后ES细胞向角膜上皮细胞方向分化（图5）；免疫组化结果显示：角膜上皮样细胞K14的表达很少，而K12及CD44的免疫细胞化学染色阳性（图6）。

图5 K12、K14及CD44 RT-PCR表达情况

图6 K12、K14及CD44免疫组化结果

3 讨论

严重的角膜损伤一直是眼科治疗的难题。一些严重的化学或热烧伤，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常导致角膜上皮的大量缺失。传统的移植方法虽有一定疗效，但由于供体缺乏、移植免疫及伦理等问题，在临床上的应用发展受到很大限制[4]。重建角膜的关键是获得足够的角膜上皮材料。本研究探索采用诱导有多向分化潜能的ES细胞向角膜上皮细胞分化，为角膜上皮移植提供无限的供体来源。

ES细胞是一种具有全能性、可无限增殖和多向分化潜能的未分化细胞，具有两个重要特性：①自我更新潜能。干细胞在未分化状态下可不断增殖，从而可自我更新。②多向分化潜能。在体内外ES细胞均有分化成许多特定细胞类型的能力。它能迁移到不同部位分化成相应的细胞类型，恢复受损细胞的功能，成为一种新型细胞替代治疗和基因治疗的途径。经丝裂霉素C处理的含LIF的MEF作为饲养层，能够抑制ES细胞的分化和促进其增殖，并使其保持未分化状态以及多向分化潜能[5]。本研究将Ⅳ型胶原作为诱导剂，加入不含LIF的培养板中，诱导体外培养的ES细胞向角膜上皮细胞分化。

GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白，作为荧光标记分子，在研究细胞的分化、细胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂质体方法将含有GFP的质粒转染至小鼠ES细胞中，选择G418筛选并纯化后的GFP阳性ES细胞。将这些能够持续表达GFP的ES细胞在诱导条件下分化成角膜上皮样细胞，并稳定表达GFP，证明GFP基因已完全整合到ES细胞基因组中，这对ES细胞在体内的分化、迁移及整合具有重要意义。

本研究对诱导分化后的ES细胞进行了形态学观察，发现分化后的细胞符合具有典型上皮细胞的形态学特征。细胞呈集落式生长，排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。对于眼表上皮而言，区分角膜上皮细胞与结膜上皮细胞是非常重要的，因为它们在功能上有很大区别，影响角膜上皮组织的移植。细胞角蛋白（cytokeratin）是细胞骨架成分中间丝的重要组成部分，是一类在上皮细胞中表达丰富的蛋白质，也是某些上皮细胞重要的标志物，其中，K14主要在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达，K12则是在角膜上皮细胞表达的角蛋白，是特异性角膜上皮细胞标志物。而CD44也存在于角膜上皮细胞中，功能与组织修复有关，它可以促进角膜上皮的愈合。本实验诱导分化的上皮细胞CD44和K12表达阳性，而表达K14阴性，说明诱导分化的细胞是角膜上皮细胞，而非结膜上皮细胞。提示ES细胞能在体外定向诱导分化为角膜上皮样细胞。本研究应用RT-PCR技术检测ES细胞及分化的角膜上皮样细胞中均有K12及CD44的表达，而结膜上皮标志物K14则无表达，证实转染GFP后的ES细胞向角膜上皮细胞方向分化。

总之，通过以上实验本研究成功建立了转染GFP基因的ES细胞系，并利用Ⅳ型胶原体外诱导ES细胞定向分化为角膜上皮样细胞，为临床治疗角膜损伤提供新的材料来源。

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