HuR蛋白对SH－SY5Y细胞活力的影响1）

孙雪菲，司沛沛，杨小荣，张 策

HuR是RNA结合蛋白（RNA－binding proteins，RBPs）中果蝇胚胎致死异常视觉（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族的一员，它通过和细胞内mRNA非翻译区富含Au元件（ARE）的结合，保持mRNA的稳定性，使之不易被降解而增强其表达，发挥其转录后的调控作用。HuR蛋白作为ELAV家族中唯一一种广泛表达的蛋白，能在多种细胞系中表达，并参与生物发育的正常生命活动过程。

SH－SY5Y细胞是1970年建自骨瘤转移灶的神经母细胞瘤SK－N－SH细胞系经三次克隆后的亚系（SK－N－SH→SH－SY→SHSY5→SH－SY5Y）。该细胞繁殖快，细胞形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究。

本实验拟通过RNA干扰技术，探讨HuR基因沉默后对SH－SY5Y细胞活力的影响，初步阐明HuR蛋白在SH－SY5Y细胞的发生和发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体 细胞培养试剂DMEM、F12、增强型考马斯蛋白定量试剂盒购自博士德，澳洲血清（FBS）购自Gibico公司。质粒提取试剂盒购自全式金生物有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Opti－MEM无血清培养基购自Invitrogen公司。兔抗人HuR抗体购自Abcam公司。细胞裂解液购自武汉碧云天生物科技有限公司。cck－8试剂盒购于Dojindo公司，乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。β－actin山羊抗兔二抗购自中杉金桥；Super ECL Plus超敏发光液购自普利莱基因技术有限公司。

1.2 细胞培养 SH－SY5Y细胞株购自上海中科院细胞库，用含有10%FBS、100U／mL青霉素、100U／mL链霉素的DMEM和F12培养基，将细胞以1×105的浓度接种于孔板或培养瓶中，在37℃含5%CO2孵箱中培养。

1.3 质粒构建与转染 HuR干扰质粒（5′－AAGGACGTAGAAGACATGT－3′）由广州复能基因构建。转染时按照转染试剂Lipofectamine 2000与质粒比例为1∶2.5转染。

1.4 Western blot检测与分析 HuR干扰质粒转染后24h裂解细胞收集蛋白，蛋白定量用增强型考马斯亮蓝蛋白定量（博士德）。10%的SDS－PAGE电泳（80V，20min；120V，90min）后，将蛋白转到PVDF膜上，TBST洗膜三次，每次5min。0.3%明胶室温封闭1h。加入 HuR（1∶3 000）、β－actin（1∶3 000）抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜后孵二抗（1∶3 000），室温孵育1.5h。洗膜后膜上铺ECL超敏发光液，用凝胶成像系统成像，并加以分析。

1.5 CCK－8（Cell counting Kit－8）的测定 96孔板中的细胞在转染24h后，每孔加入CCK－8 10μL，37℃避光培养2h，上酶标仪测定，检测波长450nm，参比波长650nm。

1.6 LDH释放的检测 六孔板中的细胞转染24h后 ，收集细胞培养液，按照说明书进行LDH活性的检测。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0分析。数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 HuR表达水平的检测 Western Blot检测结果显示：与正常组相比，干扰组HuR蛋白表达显著下调，其蛋白抑制率为77.05 %（P＜0.05）；而空质粒组、lipo2000组的HuR蛋白水平与对照组之间无统计学意义。详见图1。

图1 HuR蛋白表达水平的检测

2.2 CCK－8检测 HuR干扰组的细胞活力下降，约为对照组的52.28%（P＜0.05）；与对照组相比，lipo2000组和空质粒组的细胞活力均无统计学意义。详见图2。

图2 细胞活力观察

2.3 LDH释放的检测 与对照组相比，HuR干扰组的LDH水平增高约83.37%（P＜0.05），lipo2000组和空质粒组对LDH的释放无统计学意义。详见图3。

图3 LDH释放观察

3 讨 论

HuR可通过一定的信号途径以及剪接、磷酸化、乙酰化等多种修饰参与细胞增殖、分化等多种行为的调节[1，2]，并在神经发育和细胞分化中具有重要作用[3]。近年研究发现[4－14]，HuR在PI3K／AKT／NF－κB、p38／MAPK 等细胞信号转导通路中或应激、低氧条件启动下可以穿过细胞核到达细胞浆，通过和细胞内mRNA非翻译区富含Au元件（ARE）的结合，保持mRNA的稳定性，使之不易被降解，而加强靶因子的翻译表达。目前认为HuR在许多生理、病理过程中发挥重要作用。例如，Lal等发现HuR可通过增强多种抗凋亡蛋白（如凋亡抑制体前胸腺素α）的表达，在细胞早期的应激反应中具有抗凋亡作用[15]；HuR可上调上皮细胞生长因子及粒细胞集落刺激因子的表达而促进细胞增殖；HuR通过调控mRNA的稳定性，使环氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）蛋白表达增加，促进肿瘤细胞增殖而发挥其致癌作用[16]。

本研究发现将HuR基因沉默后，细胞活力下降，表明HuR蛋白在SH－SY5Y细胞的发生和发展中发挥重要作用。HuR沉默后，炎症因子 mRNA转录明显减少[17]。Abdelmohsen等[18]发现在H2O2诱导的氧化应激中HuR磷酸化增加导致HuR与SIRT1mRNA结合减少，SIRT1mRNA的稳定性下降，SIRT1表达下调，细胞损伤增多。因此推测，将HuR基因在人神经母细胞瘤细胞SH－SY5Y中沉默后，导致某一与细胞存活相关的靶蛋白mRNA的稳定性下降，靶蛋白表达减少，从而引起细胞活力下降，细胞损伤。但具体机制还有待进一步研究。

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