阿卡波糖、二甲双胍、吡格列酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织肿瘤坏死因子－α及细胞色素P4502E1的影响＊

于红艳，张松筠，周晓映，魏 红，康亚星，李京芳 ，魏东敏，刘 红，张庆九

(1.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056006; 2.河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000;3.河北省胸科医院，河北 石家庄 050048; 4.河北省正定县医院，河北 石家庄 050800)

近年来，肥胖、高血脂、代谢综合征、糖尿病患者越来越多，由此引发的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率日益增高，其发病机制尚未完全明确，但目前普遍认为胰岛素抵抗参与该病的发生发展过程。阿卡波糖、二甲双胍、吡格列酮可从不同途径增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗。本研究中以高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，观察细胞色素P450(CYP2E1)、肿瘤坏死因子 －α(TNF－α)在肝脏中的表达及阿卡波糖、二甲双胍、吡格列酮对NAFLD的预防作用。

1 材料与方法

1.1 材料

动物:雄性SD大鼠60只，清洁级，体重(180±10)g，购于河北医科大学动物实验中心，动物许可证号为SCXK(冀)2008－1－003。分笼喂养，动物房内通风良好，室温保持在18～25℃，相对湿度40% ～60%，光照时间每天12 h。

药物及试剂:阿卡波糖(50mg/片，拜耳医药保健有限公司，批号为BJ10507);盐酸二甲双胍片(500mg/片，上海施贵宝制药公司，批号为1112103);盐酸吡格列酮片(15mg/片，天津武田药品有限公司，批号为110501)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)试剂盒(北京柏定生物工程有限公司);碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(北京利德曼生化技术有限公司);血糖测定采用葡萄糖氧化酶法;胰岛素放免试剂盒(北京福瑞生物工程公司);甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。CYP2E1多克隆抗体购于武汉博士德公司;兔抗TNF－α多克隆抗体购于北京博奥森生物科技有限公司。

1.2 试验方法

动物模型建立与分组:将大鼠随机分为5组，每组10只。正常对照组(NC组)，普通饲料喂养12周;非酒精性脂肪肝组(NF组)，高脂饮食喂养12周，高脂饮食配料包括80.5%基础饲料、2%高胆固醇、7%猪油、10%蛋黄粉及0.5%胆盐;阿卡波糖干预组(AN组)，高脂饮食喂养同时加用阿卡波糖100mg/(kg·d)灌胃12周;二甲双胍干预组(MN组)，高脂饮食喂养同时加用二甲双胍500mg/(kg·d)灌胃12周;吡格列酮干预组(PN组)，高脂饮食喂养同时加用吡格列酮15mg/(kg·d)灌胃12周。

标本制备与保存:饲养12周，大鼠禁食12 h，麻醉后从下腔静脉取血，分离血清，－70℃保存，以检测血清学指标。迅速取出肝脏，称重，切取数块右叶肝组织保存于液氮内，以提取蛋白及总RNA，并取右叶肝组织固定于10%甲醛内，用于病理学检查。

观察指标与检测方法:ALT，AST，ALP，TG，TC，FFA 及空腹血糖(FBG)均严格按照试剂说明书由自动生化仪进行测定，胰岛素采用放射免疫法测定，计算胰岛素抵抗指数(HOMA－IR=FBG×FINS/22.5)[1]。

组织病理学观察:将取出的肝组织浸泡在10%甲醛溶液内固定，石蜡包埋，切片，行HE染色观察肝细胞脂肪变性程度、炎性活动度及肝纤维化的程度，相关标准参照Dixon等[2]提出的肝细胞脂肪变分级方法及2000年全国肝病会议通过的肝纤维化分期方法[3]。

CYP2E1及TNF－α免疫组化检测:免疫组化法依照试剂盒操作步骤进行。所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内分析。

RT－qPCR:用Trizol试剂盒提取肝组织标本总RNA，在紫外分光光度仪上测定RNA样品260 nm与280 nm波长处的吸光度(OD)值以计算RNA浓度，然后RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA。目的基因CYP2E1和TNF－α以及内参照β－actin的引物序列见表1，实时定量PCR在ABIPrism 7000上进行操作完成。根据实时荧光定量PCR中 C t值计算出ΔC t值。采用相对定量2－ΔΔC t法比较目的基因mRNA的表达差异，PCR中每个样本均重复3次，取平均值。

表1 CYP2E1及TNF－αmRNA的引物序列及产物大小

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 血糖、肝功能及血脂

结果见表2。与正常对照组相比，非酒精性脂肪肝组中FINS及HOMA－IR均有明显的上升趋势(P＜0.05);与非酒精性脂肪肝组相比，3个干预组的FINS及HOMA－IR均明显下降(P＜0.05)，其中二甲双胍、吡格列酮两组间无明显差异(P＞0.05)，阿卡波糖组下降幅度不及二甲双胍组和吡格列酮组(P＜0.05)。与正常对照组相比，非酒精性脂肪肝组ALT，AST，ALP活性以及TG，TC，FFA含量均明显升高(P＜0.05);与非酒精性脂肪肝组相比，3个干预组ALT，AST，ALP活性以及 TG，TC，FFA 含量均明显下降(P ＜0.05)，其中二甲双胍、吡格列酮两组间无显著性差异(P＞0.05)，阿卡波糖组下降程度不及二甲双胍、吡格列酮组(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血糖、肝功能及血脂的比较(±s)

表2 各组大鼠血糖、肝功能及血脂的比较(±s)

注:与 NC 组相比，△P ＜0.05;与 NF组相比，▲P ＜0.05;与 MN 组相比，★P ＜0.05;与 PN 组相比，＊P ＜0.05。

血糖参数 肝功能血脂组别NC组NF组MN组PN组AN组FBG(mmol/L)6.02 ± 0.87 6.98 ± 0.48△5.92 ± 0.42▲5.46 ± 0.37▲6.20 ±0.33▲★＊FINS(mU/L)21.13 ± 3.98 27.51 ± 4.02△23.49 ± 3.12▲22.91 ± 2.36▲24.83 ±2.31▲★＊HOMA－IR 5.65 ± 1.24 8.53 ± 1.92△6.18 ± 1.31▲5.56 ± 0.98▲6.84 ± 1.03▲★＊ALT(U/L)52.56 ± 6.78 143.80 ± 76.34△79.86 ± 28.40▲84.73 ± 31.18▲76.43 ±26.54▲★＊AST(U/L)196.34 ± 12.97 358.76 ± 97.20△221.30 ± 34.21▲235.23 ± 33.62▲216.34 ±32.32▲★＊ALP(U/L)144.54 ± 23.48 207.47 ± 35.39△153.32 ± 44.20▲160.02 ± 45.32▲153.28 ±43.32▲★＊TG(mmol/L)2.70 ± 0.32 5.67 ± 0.54△3.96 ± 0.23▲3.60 ± 0.30▲3.87 ±0.26▲★＊TC(mmol/L)0.98 ± 0.25 2.76 ± 0.28△1.70 ± 0.34▲1.68 ± 0.26▲1.67 ±0.29▲★＊FFA(μmol/L)408.63 ± 31.80 584.40 ± 51.74△493.19 ± 38.89▲490.21 ± 43.67▲482.28 ± 37.68▲★＊

2.2 肝组织病理HE染色

正常对照组HE染色后可见正常肝小叶结构，未见肝细胞脂肪变性或坏死及炎性细胞浸润;非酒精性脂肪肝组HE染色后可见肝小叶结构紊乱或消失，肝细胞肿大，出现中重度脂肪变性，肝小叶可见以单核细胞浸润为主的炎症反应;二甲双胍干预组、吡格列酮干预组HE染色后亦可见肝小叶结构紊乱、肝细胞肿大及脂肪变性，两组间无明显差异，程度均轻于非酒精性脂肪肝组。阿卡波糖干预组肝小叶结构紊乱及脂肪变性程度虽轻于非酒精性脂肪肝组，但重于二甲双胍干预组和吡格列酮干预组。见图1。

2.3 TNF－α与CYP2E1m RNA及其蛋白表达

Real time PCR测定结果显示:与正常对照组相比，非酒精性脂肪肝组TNF－α及CYP2E1mRNA表达量均明显增多(P＜0.05);与非酒精性脂肪肝组相比，3个干预组TNF－α及CYP2E1m RNA表达量均明显减少(P＜0.05)，其中二甲双胍、吡格列酮两组间无显著差异(P＞0.05)，阿卡波糖组减少程度轻于二甲双胍、吡格列酮组(P ＜0.05)，见图 2。

图1 各组大鼠肝脏HE染色改变(×400)

图2 各组大鼠肝脏CYP2E1mRNA及TNF－αmRNA的变化

免疫组化染色法示:正常对照组TNF－α及CYP2E1阳性细胞极少;与正常对照组相比，非酒精性脂肪肝组TNF－α及CYP2E1阳性细胞显著增加(P＜0.01)，棕黄色颗粒主要分布于中央静脉周围，与脂肪变一致;与非酒精性脂肪肝组相比，3个干预组TNF－α及CYP2E1阳性细胞显著减少(P＜0.01)。与Real time PCR测定的mRNA结果相似，二甲双胍、吡格列酮两组间TNF－α及CYP2E1阳性细胞减少无显著性差异(P＞0.05)，阿卡波糖组阳性细胞减少程度轻于二甲双胍、吡格列酮组(P＜0.05)，见图3和图4。

图3 各组大鼠肝脏TNF－α阳性细胞变化(×400)

图4 各组大鼠肝脏CYP2E1阳性细胞变化(×400)

3 讨论

目前，NAFLD发病机制尚未完全明确，但人们普遍接受Day等[4]提出的“二次打击学说”:初次打击为胰岛素抵抗导致的肝脏脂肪沉积，肝细胞脂肪变性;第二次打击为各种原因引起的氧化应激，使肝细胞膜发生脂质过氧化损伤，最终导致肝细胞坏死。

CYP2E1是细胞色素P450的2E1亚型，为微粒体混合功能氧化酶系中最重要的氧化酶，参与肝脏的代谢与解毒，高表达后可使肝细胞中氧化反应增强，造成肝细胞膜脂质过氧化，降低抗氧化系统的保护作用，损伤肝细胞[5]。研究发现，NAFLD肝细胞中CYP2E1表达增多，参与NAFLD的形成[6]。机体处于胰岛素抵抗状态时，胰岛素将会失去对CYP2E1的抑制作用，使其含量增多，活性增强，导致氧化应激产物增多，激活肝脏星状细胞，出现肝纤维化[7]。CYP2E1过度表达可导致氧化应激增强，减少糖原储备，促进葡萄糖的合成，脂肪蓄积增多，减少肝脏中胰岛素信号，增强胰岛素抵抗，加重肝脏损伤[8]。因此，在NAFLD中，胰岛素抵抗和CYP2E1是相互独立又相互作用的两个因素。

TNF－α为损害肝脏的重要因子之一。NAFLD患者血浆中TNF－α及其受体水平明显升高，且肝组织中TNF－α及其受体mRNA表达水平升高[9]。TNF－α可激活细胞内JNK等信号通路，导致胰岛素抵抗，而且有证据显示，胰岛素抵抗亦可促进TNF－α的产生，TNF－α可以促进肝脏脂肪酸的合成，增加血液中甘油三酯含量，刺激肝脏合成过多极低密度脂蛋白，参与肝脏纤维化的病理过程[10]。

阿卡波糖、二甲双胍及吡格列酮可分别通过不同的作用机制改善胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗。本研究中，以高脂饮食饲养大鼠，同时应用阿卡波糖、二甲双胍及吡格列酮进行干预，结果显示，与非酒精性脂肪肝组相比，阿卡波糖、二甲双胍及吡格列酮干预组大鼠肝脏病理改变均减轻，血清 AST，ALT，ALP，TG，TC，FFA以及胰岛素抵抗指数均较低，提示3种药物对非酒精性脂肪肝均有预防作用。非酒精性脂肪肝组TNF－α及CYP2E1的表达水平明显高于正常对照组，而3个干预组TNF－α及CYP2E1表达水平均有明显的下降趋势，提示阿卡波糖、二甲双胍、吡格列酮对非酒精性脂肪肝的预防作用可能与其对TNF－α及CYP2E1的调节有关。但阿卡波糖对非酒精性脂肪肝的预防作用明显弱于二甲双胍、吡格列酮，可能与后两种药物对胰岛素抵抗的改善作用更强有关。

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