裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定

邓俊花 林祥梅 张永宁 冯春燕 王彩霞 吴绍强

裂谷热（Rift valley fever，RVF）是由蚊子作为传染媒介的病毒性传染病，主要感染反刍动物，如绵羊、山羊和牛，可引起怀孕动物流产和幼小动物死亡［1］。在疫病流行期间，也会引起人类发病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定上报的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。历史上，裂谷热主要在非洲撒哈拉以南地区流行，2000年8月向北蔓延到亚洲的阿拉伯半岛（也门和沙特阿拉伯），对我国构成了严重威胁［2］。

为了有效监控并防止裂谷热疫情的传播，Sall等［3，4］建立了裂谷热的巢式RT-PCR检测方法，并在肯尼亚（1998年）及南非（1999年）的两次疫情诊断中发挥了重大作用。Drosten等［5，6］建立了裂谷热一步法实时定量RT-PCR检测方法。但由于安全有效阳性质控物质的缺乏，导致上述检测技术难以在非疫区推广应用。近几年，Pasloske等［7，8］提出了一种新的RNA质控品制备技术，即装甲RNA（Armored RNA）技术，利用该技术制备的假病毒颗粒稳定、安全，并能有效监控RNA样品核酸制备及RT-PCR反应的全过程。病毒样颗粒（Virus like particle，VLP）是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，但可以组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，具有较强的免疫原性及较好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样颗粒与重组质粒DNA（如基因疫苗）融合，转录成的重组RNA包入病毒样颗粒内，即形成假病毒（pseudovirus）。

RVFV属布尼亚病毒科白岭病毒属（phlebovinzs）RNA病毒，具包膜，核酸共分L、M和S 3个节段，L节段编码RNA多聚酶，M节段编码病毒包膜蛋白，均为负链RNA。S节段编码核蛋白和非结构蛋白，部分为负链，其他部分为正链，即呈所谓双义（ambisense）结构。补体结合反应抗原同部分S节段编码的N蛋白相关。

本研究针对裂谷热病毒中比较保守的S基因设计引物和探针，研制裂谷热假病毒颗粒，并进一步借助荧光RT-PCR方法进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

MS2-T质粒，是包含MS2第12-1796位的T载体重组质粒，由华大吉比爱生物技术有限公司陈唯军教授惠赠。pGEM-T-RVF质粒，是包含RVFV S基因第12-576位的T载体重组质粒，由本实验室构建、保存。pTrcHis2A载体购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank上裂谷热病毒S基因序列（GenBank登录号DQ380149）设计了荧光RT-PCR引物rvfv-u1/L1和探针rvfv-p1［9］，同时设计了2套PCR引物RVF-F/R（分别引入酶切位点Pst I和Hind Ⅲ）和Vector-F/R。引物序列见表1。

表1 所用基因的引物及探针序列

1.2.2 p-MS2假病毒载体构建 MS2-T质粒和表达载体pTrcHis2A分别进行Nco I和Bgl II双酶切，酶切体系为 ：Nco I/Bgl II 1μL，10×K buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，模板 1μg，补水至 20μL，37℃ 2h。酶切产物分别命名为pTrcHis2A（N/B）和MS2-T（N/B）。分别将酶切产物进行胶回收纯化，用T4 DNA连接酶连接，连接体系为：10× buffer 1μL，T4 酶 5 U，pTrcHis2A（N/B）50ng，MS2-T（N/B）150ng，25℃，10min，然后立即放冰上。将连接产物进行转化，挑取单克隆摇菌，以Vector-F/R为引物对菌液进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的克隆抽提质粒，送北京诺赛基因组研究中心测序。测序正确的菌株命名为p-MS2，于-86℃保存备用。

1.2.3 p-MS2-RVF重组质粒构建 pGEM-T-RVF质粒与p-MS2质粒分别进行Pst I和Hind Ⅲ双酶切。将酶切产物回收纯化，用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化，分别以RVF-F/R、Vector-F/R为引物进行PCR鉴定，测序。测序正确菌株命名为p-MS2-RVF，于-86℃保存备用。

1.2.4 p-MS2-RVF假病毒颗粒纯化及特性鉴定

1.2.4.1 假病毒颗粒的表达与初步纯化 p-MS2-RVF重组菌加入1mmol/L的IPTG诱导表达16h，离心，菌体沉淀用1×TE buffer混匀，按1 1000加入溶菌酶（25mg/mL），37℃裂解处理30min，4℃，12000r/min离心15min，上清即为含假病毒颗粒的表达产物。按表达产物∶酶量=125 1 1分别加入RNaseA（1mg/mL）和DNase I（1mg/mL）37℃消化1h。消化产物依次经过盐沉淀、氯仿作用后，得到粗纯的假病毒颗粒溶液。参照文献［10］。

1.2.4.2 假病毒颗粒的纯化 在超速离心管中制备蔗糖密度梯度溶液，加入含假病毒颗粒的溶液，最后 用 SM（0.1mol/L NaCl，8mmol/L MgSO4·7H2O，50mmol/L Tris-Cl pH7.5，2％明胶溶液）溶液补满。分级梯度于4℃，40000r/min，离心12h。回收含假病毒颗粒的区域，再超速离心，去上清，加入适量SM溶液，重悬沉淀，进行PCR与RT-PCR鉴定纯化效果。

1.2.5 假病毒颗粒特性鉴定 敏感性试验：将50μL/管纯化的假病毒颗粒溶液分别放置于56℃（1d）、37℃（20d）、 常温（30d）、 4℃（30d）、 -20℃（60 d），每种条件下5份样本，每份样本各取10μL混匀，进行样品处理后RT-PCR鉴定。RNase A攻击试验：在50μL假病毒颗粒溶液中分别加入RNase A（1mg/mL）1-4μL后，37℃放置 30min，对照组不加RNase A，每种条件下5份样本，每份样本各取10μL混匀，RNA抽提后进行RT-PCR鉴定。电镜观察：纯化的假病毒颗粒溶液经1％醋酸双氧铀负染后，利用透射电镜（JEM-1400）进行形态鉴定。

1.2.6 裂谷热假病毒颗粒荧光RT-PCR方法鉴定

将裂谷热假病毒颗粒溶液进行10倍系列稀释，采用Trizol（Invitrogen，USA）试剂分别提取RNA，对应4.25×108-4.25×102copies/mL，裂谷热荧光RT-PCR检测体系如下：10×PCR Buffer（Mg2+）2.5μL，MgCl2（2.5mmol/L）5.0μL，d NTP（各 2.5mmol/L）2.5μL，rTaq DNA Polymerase 2.5 U，AMV-XL 2.5 U，RNase Inhibitor 20 U，Rvfv-u1/L1（10μmol/L）10 pmol/10 pmol，Rvfv-p1（10μmol/L）10 pmol， 模 板 RNA 10ng。RT-PCR反应程序：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，扩增40个循环，每个循环反应结束时收集荧光信号。

2 结果

2.1 p-MS2质粒测序结果

p-MS2质粒经测序，MS2目的片段完全正确插入载体pTrcHis2A中。

2.2 p-MS2-RVF菌液PCR鉴定及测序结果

以p-MS2-RVF菌液为模板，分别以RVF-F/R，Vector-F/R为引物进行PCR鉴定。PCR产物经1％琼脂糖电泳（图1）显示，目的条带分别在500-700bp、2000-3000bp之间，与预设计的目的基因片段大小（584bp和2 479bp）相符。经测序RVFV目的片段已正确插入至载体p-MS2中。

2.3 假病毒颗粒纯化效果鉴定

纯化产物作为RT-PCR反应模板，其中一组不经过反转录直接进行PCR鉴定，检测结果为阴性，表明制备的假病毒颗粒溶液中无DNA污染。另一组样本进行RT-PCR鉴定，检测结果呈阳性，表明裂谷热基因片段已经重组于假病毒颗粒中，而且模板以RNA形式存在（图2）。

图1 裂谷热p-MS2-RVF菌液PCR鉴定

图2 假病毒颗粒纯化效果

2.4 纯化后的假病毒颗粒温度敏感试验

经试验，假病毒颗粒溶液在37℃情况下至少可以保存20d，随着保存温度降低，保存时间越长。由此可以看出，该假病毒颗粒具有良好的稳定性（图 3）。

图3 假病毒颗粒温度敏感性检测结果

2.5 稳定性试验（RNase A攻击试验）

用RNaseA处理的假病毒颗粒溶液与对照组样品分别进行RT-PCR鉴定，检测结果一致，表明制备的假病毒颗粒溶液可抵抗RNaseA的降解（图4）。

2.6 电镜观察

超声破碎表达产物经SYBR Green染色后通过蔗糖密度梯度离心，可以看到在密度为35％区域内有绿色荧光条带出现。利用透射电镜对假病毒颗粒纯化样品进行观察图5，可以看到直径大约为26nm的多边形颗粒，即诱导表达的假病毒颗粒。

图4 假病毒颗粒稳定性检测结果

图5 假病毒颗粒的电镜观察结果

2.7 假病毒颗粒荧光RT-PCR鉴定及其敏感性检测

如图6所示，随着稀释倍数的增加，Ct值逐渐增加。经多次试验表明，本方法对裂谷热假病毒颗粒溶液最低检测可达4.25×102copies。

图6 不同稀释浓度假病毒颗粒溶液与荧光信号Ct值关系图

3 讨论

早期MS2噬菌体的研究发现，在复制酶5'端存在一个由19个碱基组成的茎环结构（发夹结构），碱基序列为5'-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3'，是包膜蛋白二聚体与RNA相互作用的部位，这种相互作用形成的复合物是噬菌体自我包装的信号，在复合物的基础上，成熟酶蛋白与其他包膜蛋白分子结合并在自由能的驱动下形成相应的空间构象，完成MS2噬菌体的组装［8，11-17］。本研究在该结构相应的基因序列下游插入了外源基因RVFV的S基因片段，借助载体上的转录启动子和终止子进行基因调节，表达产物经过菌裂解，双酶（DNase I和RNase A）消化，梯度离心等处理，获得含有RVFV外源基因的假病毒颗粒。

研究表明没有成熟酶蛋白的VLPs，其内包装的 RNA 易被 RNase降解［18，19］。另外，在成熟酶蛋白的基因上存在一个与包装位点相似的一致性序列［20］，有研究［21］认为这个类包装位点的存在使MS2的包膜蛋白在包装时出现了协同效应，这种协同效应可以使RNA在低浓度的时候就可以引起包装，增加了包装的效率。另外，成熟酶蛋白有两个位点与RNA相互作用［22］，这使得MS2包膜蛋白的包装更容易进行。本研究通过对制备的假病毒颗粒先后进行温度敏感试验、RNase A攻击试验数据表明，此假病毒颗粒具有耐RNase的特性，稳定性良好，在室温可以保存至少30d，4℃可以保存更长时间，从而解决了RNA质控品使用、保存和运输的稳定性问题。

在大肠杆菌中表达的假病毒颗粒主要存在于裂解物的上清中，由于在裂解过程中，大量复制的质粒DNA也同样随病毒样颗粒进入上清中，如果加入DNase I的比例不当，很难将质粒DNA完全降解。本研究通过摸索，优化表达产物和酶加入的比例，纯化的假病毒颗粒溶液先进行纯度鉴定，提取的RNA直接进行PCR鉴定，呈阴性，表明此溶液中无DNA污染；另一组RNA先反转录再进行PCR鉴定，呈阳性，则表明此病毒颗粒中包含有RVFV外源基因。进一步以假病毒颗粒提取的RNA为材料，进行荧光Real-time RT-PCR方法鉴定，该方法中裂谷热假病毒颗粒溶液最低检测限可达4.25×102copies。

4 结论

在国内外首次构建了包裹裂谷热病毒S基因片段 RNA的假病毒颗粒，稳定性良好，具有耐RNase的特性，安全无污染，易运输。研制的裂谷热假病毒颗粒，凭借荧光RT-PCR方法最低可达到4.25×102copies检测限，可作为参比物质应用于裂谷热临床分子生物学检测方法。

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