厄洛替尼对核转录因子κB表达以及单核细胞凋亡的影响

孙晓东 王 原 代素梅 张绍华 王海波 杨照环 刘华群 侯秀珍 于翠萍(唐山市工人医院肿瘤科，河北 唐山 063000)

单核细胞是机体先天性免疫应答和获得性免疫应答的重要成员之一〔1〕。单核细胞的异常发育，必然导致机体免疫系统功能和机体内环境紊乱，引发多种疾病。骨髓造血干细胞分化为单核细胞受多种细胞因子影响，其中表皮生长因子(EGF)是骨髓造血干细胞分化的重要生长因子，可以促进成纤维细胞、间充质细胞和肿瘤细胞产生一些趋化因子，尤其是单核细胞趋化因子(MCP-1)蛋白。作为单核巨噬细胞特异性的趋化因子，MCP-1在诱导单核细胞成熟、趋化以及参与炎症和肿瘤组织浸润等生物学效应中发挥着重要的作用〔2〕。厄洛替尼作为EGF受体的特异性抑制剂已经在临床中广为使用，多数癌症患者从中受益。然而，厄洛替尼是否能够通过抑制EGF对单核细胞的作用，从而改变单核巨噬细胞的功能活性是本研究拟解决的问题。

1 材料与方法

1.1 单核细胞培养 把单核细胞系RAW264.7(购自美国ATCC)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，悬浮于含10%小牛血清的 RPMI1640培养基中，37℃ 5%CO2条件下培养2 h，收集未贴壁细胞置于新的培养瓶中，调整细胞密度至1×106/ml，用于单核细胞的传代培养。将离体培养的单核细胞分为四组:空白对照组、EGF处理组、厄洛替尼处理组、EGF联合厄洛替尼处理组。EGF、厄洛替尼作用浓度分别为 10 ng/ml、4 μmol/L。联合组为EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2 方法

1.2.1 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化 调节RAW264.7细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，转染方法和转染后处理同前。转染后48 h各组弃培养液，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞抑制率 =〔(空白对照组 OD值－各实验组OD值)/空白对照组OD值〕×100%。

1.2.2 单核细胞凋亡的检测 采用流式细胞仪DNA倍体分析法。取对数生长期的以上四组细胞，胰酶消化，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混匀，4℃固定30 min。再以1 000 r/min离心5 min，弃培养液，用PBS洗2次，置于4℃室温避光反应15 min;在1 h内上流式细胞仪检测，结果用Muticycle软件系统进行分析，实验重复3次。

1.2.3 Western印迹检测核转录因子(NF)-κB的p65蛋白水

平 收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后－80℃保存备用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，完毕后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脱脂奶粉封闭，后放入含一抗的Tris盐酸缓冲液(TBST)溶液，4℃过夜，洗膜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，目标蛋白质用二氨基联苯胺(DAB)显色。计算机扫描，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白做参照，分析处理。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，结果数据用±s表示，组间均数比较用两样本t检验。

2 结果

2.1 厄洛替尼对单核细胞生长的抑制情况 厄洛替尼对人单核细胞的生长具有抑制作用，不同浓度的厄洛替尼对单核细胞均有抑制性，其抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 厄洛替尼作用单核细胞的抑制率(%)

2.2 厄洛替尼对细胞凋亡的影响 空白对照组、EGF处理组、厄洛替尼处理组、EGF联合厄洛替尼处理组的凋亡率分别为5.43% ±0.67%、12.1% ±1.56%、25.3% ±0.37%和33.2% ±1.37%，析因设计方差分析各组间差异显著(P＜0.05)。

2.3 Western印迹结果 厄洛替尼可以显著地抑制单核细胞分泌NF-κB，进而诱导单核细胞的凋亡。

3 讨论

单核细胞的分化发育是一个复杂的生命过程，其中涉及多种信号途径的协同和调控。某些细胞因子，如白细胞介素(IL)可刺激多能干细胞向髓样干细胞分化〔3〕，而巨噬细胞集落因子(GM-CSF)能促使髓样干细胞进一步分化为单核细胞〔4〕。外周血单核细胞在GM-CSF和IL-4的共同作用下可以在体外分化为树突细胞，Chomarat等〔5〕研究发现IL-6可以抑制单核细胞向树突细胞方向分化，同时促进其向巨噬细胞分化。在肿瘤发展过程中，炎症性单核巨噬细胞浸润起着一定作用。而目前发现给予厄洛替尼处理后，EGF对单核细胞的凋亡具有抑制作用，并在抑制单核细胞凋亡进而抑制单核巨噬细胞趋化过程中得以体现，从一个较新的角度提示厄洛替尼对EGF受体相关肿瘤浸润和转移的抑制作用，为临床治疗肿瘤提供了一种新的思路和探索。

本研究结果显示，厄洛替尼抑制单核细胞凋亡，通过抑制其分泌NF-κB因子，进而诱导单核细胞的凋亡。NF-κB发生核转位，从而启动多种基因转录。NF-κB因子是一种重要的细胞内信号因子，由P50和P65组成二聚体，调节许多与细胞生长和分化相关的基因表达〔6〕。在多种人类肿瘤中NF-κB促进肿瘤的恶性化是多方面的，其调控的靶基因参与肿瘤的浸润、转移、血管生成和肿瘤的抗凋亡〔7〕。NF-κB调节单核细胞的经典途径为，未激活的NF-κB以P50/65-IκBα二聚体形式储存于胞浆中。在外界条件刺激下，IκBα发生磷酸化降解，导致P50/65核定位序列(NLS)暴露〔8〕。在肿瘤发展过程中，NF-κB可以促进肿瘤转移和炎症性单核巨噬细胞浸润。而给予厄洛替尼处理后，EGF对单核细胞分泌NF-κB具有抑制作用，这种作用在单核巨噬细胞趋化过程中得以体现。

本研究表明，厄洛替尼可以有效抑制单核细胞凋亡和迁移，进而调控单核细胞的分化。这一结果阐明了厄洛替尼对单核细胞分化的调控，进一步从细胞水平为其抗肿瘤浸润和转移的抑制作用提供依据。

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