FGF21在高山红景天甙治疗糖尿病肾小球硬化中的作用

高文慧 徐 锋 吴 曼 韩洪波 罗 萍 孙广东 (吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 3004)

糖尿病肾病(DN)是中老年患者导致终末期肾衰竭的首要病因〔1〕。肾小球硬化是晚期 DN的病理特征，细胞外基质(ECM)积聚是肾小球硬化发生的基础，纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)在肾小球硬化中发挥重要作用〔2〕。成纤维细胞生长因子(FGF)21属于FGF家族新成员，可以调节血脂代谢，降低血糖并保护胰腺β细胞的数量及功能，不会引起低血糖。生酮饮食饲养的小鼠可以通过过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)途径诱导FGF21的表达增加，而肾组织中的PAI-1表达略呈下降趋势，与FGF21的高表达呈负相关〔3〕。高山红景天甙(SS)来自长白山地区珍稀药用植物高山红景天，早期研究认为SS可以降低阿霉素肾病大鼠肾组织PAI-1水平，起到延缓肾小球硬化进展的作用〔4〕。本实验观察SS治疗糖尿病大鼠对于FGF21 mRNA的影响，探讨其是否可以通过影响肾小球PAI-1的表达水平从而起到延缓肾小球硬化的作用。

1 材料与方法

1.1 动物和分组 成年雄性Wistar大鼠24只，体重220～240 g，由吉林大学基础学院实验动物中心提供。随机分为正常对照组(NC组)、肥胖组(OB组)、糖尿病组(DM组)和SS组。

1.2 主要试剂 链脲佐菌素(STZ):美国Sigma公司;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;增强化学发光(ECL)试剂盒:美国PIERCE公司;PAI-1(612024)抗体:美国BD生物公司提供;RNA STAT-60试剂:美国Tel-Test Inc公司;PAI-1、FGF21引物由上海生物工程技术有限公司合成;RT-PCR逆转录试剂盒，SYBR Green PCR试剂:日本Takara公司。

1.3 主要仪器 血糖分析仪、血糖试纸条:美国罗氏公司;O-lympus BX40显微镜:日本Olympus公司;Thermo Shandon半自动石蜡切片机:英国Shandon公司;图像分析系统:北京航天航空大学;DYY-8C电泳仪、DYCP-40C型干板转移槽:北京市六一仪器厂。7300系列实时荧光定量PCR系统:爱普拜斯应用生物系统贸易有限公司(上海)。

1.4 方法

1.4.1 SS的制备 高山红景天5 kg磨成细末，以70%乙醇浸泡24 h后蒸馏至无乙醇，加等量石油醚混匀后静置分层，取水层，依次以氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取3次，获得水层经蒸馏浓缩，752紫外分光光度计扫描，与标准品进行比较，得浓缩液500 ml于4℃冰箱内贮藏备用。

1.4.2 模型制作 大鼠适应性饲养7 d后，按照文献进行糖尿病模型制备〔5〕，NC组(n=6)给予普通饮料，自由饮水。OB组、DM组和SS组大鼠给予高脂颗粒饲料(n=6)。8 w后，DM组及SS组大鼠空腹12 h后给予低剂量STZ(30 mg/kg)单次腹腔注射，NC组及OB组大鼠给予单次腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液。7 d后大鼠尾静脉取血测血糖及尿糖试纸条检测尿糖，血糖浓度＞16.7 mmol/L、尿糖～为DM模型成功，未达到标准的大鼠被剔除。

1.4.3 给药方法 自造模成功后动物饲养4 w后开始给药治疗。SS组大鼠给予SS液1.5 ml(0.5 ml原药+1.0 ml生理盐水，相当于生药20 g·kg-1·d-1)每日1次，连续灌胃8 w，NC、OB及DM组大鼠均同时给予等量生理盐水灌胃。

1.4.4 标本收集 试验前、中不同时间点及试验终点均代谢笼收集大鼠24 h尿液用于检测尿蛋白;试验前、中不同时间点及试验终点大鼠尾静脉采血测血糖;试验终点大鼠心脏取血后取肾:左肾下极肾组织10%甲醛固定用于组织学检测，其余肾组织分装若干于-70℃冻存以提取总RNA及蛋白，右肾用于提取肾小球，肝组织若干于-70℃冻存以提取总RNA。

1.4.5 分离肾小球 应用筛网法提取大鼠肾小球。新鲜肾脏称重后去包膜，切碎，置于孔径200、150、75 μm筛网中(自上而下)，4℃充分研磨后PBS缓冲液反复冲洗，收集底层75 μm筛网存留的肾小球，1 500 r/min离心5 min，弃去上清后分装在1.5 ml EP管中-70℃冻存，用于提取肾小球mRNA和蛋白。

1.4.6 指标检测 考马斯亮蓝法测定尿蛋白定量;罗氏血糖分析仪检测血糖;自动生化分析仪检测血浆白蛋白(ALB)、肌酐(Scr)、总胆固醇(CHO)及甘油三酯(TG)水平;PAS染色观察肾脏病理改变;Western印迹检测肾小球PAI-1蛋白表达水平;实时定量PCR检测肾小球PAI-1、肝脏FGF21 mRNA表达，应用β-actin为内参以2-ΔΔCt公式计算mRNA相对表达量。

1.5 统计学方法 应用PRISM统计软件进行分析，实验数据采用±s表示，两组间行t检验，多组间行ANOVA分析。

2 结果

2.1 SS对糖尿病及DN的治疗作用 与NC组大鼠比较，OB组大鼠体重、TG明显升高(P＜0.05);DM组大鼠血糖、体重、血脂及24 h尿蛋白较NC组明显升高(P＜0.05)，而血中ALB显著降低(P＜0.05)。SS治疗可明显降低血糖、血脂及24 h尿蛋白定量(P＜0.05)，而ALB水平显著升高(P＜0.05);同时PAS染色发现DM组大鼠肾小球系膜区增宽程度较NC组大鼠明显增加，SS能够明显减轻糖尿病时肾小球系膜区的变化。见表 1，图 1。

表1 高山红景天甙对糖尿病大鼠体重、血糖、血脂及24 h尿蛋白定量的影响(±s ，n=6)

表1 高山红景天甙对糖尿病大鼠体重、血糖、血脂及24 h尿蛋白定量的影响(±s ，n=6)

与NC组比较:1)P＜0.05;与DM组比较:2)P＜0.05

组别 体重(g) 血糖(mmol/L) CHO(mmol/L) TG(mmol/L) ALB(g/L) 尿蛋白定量(mg)NC 436.6±16.2 7.4±0.45 1.33±0.12 0.75±0.14 33.73±3.19 3.0±1.26 OB 560.1±27.41) 7.8±0.36 2.40±0.45 1.58±0.201) 34.67±1.78 4.0±1.03 DM 501±13.61) 26.0±1.101) 2.62±0.591) 1.69±0.241) 20.7±1.971) 75.9±14.851)SS 513.7±13.71) 20.2±1.261)2) 1.88±0.151)2) 1.47±0.101)2) 25.82±1.401)2) 61.2±10.71)2)

图1 高山红景天甙对各组大鼠肾小球硬化的影响(PAS，×400)

2.2 SS对PAI-1的影响 DM组大鼠肾小球中PAI-1 mRNA(5.31±0.59)及蛋白质(2.50±0.21)表达水平较 NC组(1.00±0.10，1.00±0.08)及 OB 组(1.07±0.19，1.33±0.09)显著升高(P＜0.05)，SS治疗可明显降低肾小球中PAI-1 mRNA(2.55±0.09)及蛋白(173.0±0.09)水平(P＜0.05)，PAI-1的变化与各组大鼠肾小球系膜基质沉积的趋势相同。见图2。

2.3 SS对FGF21表达的影响 高脂饮食联合小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠肝脏组织中FGF21 mRNA水平(4.93±0.83)较 NC组(1.01±0.14)显著增加(P＜0.05)，OB组FGF21 mRNA水平为1.42±0.58;而SS治疗后该组大鼠肝脏FGF21 mRNA的水平(7.24±0.99)较DM组进一步升高(P＜0.05)，与血糖的下降及PAI-1表达变化呈负相关。

图2 高山红景天甙对肾小球中PAI-1水平的影响

3 讨论

一部分糖尿病患者在发生代谢异常平均15年后会进展为DN，早期表现为肾小球基底膜增厚、轻度系膜增宽及小动脉透明样变性，1型及2型糖尿病患者有较多的相似性，最终形成显著的系膜基质增加导致KW结节形成〔6〕，上述病变的病理基础是ECM积聚，而PAI-1在引起ECM积聚致DN的过程中起到决定性作用〔7〕，抑制PAI-1活性可缓解DN的进展〔2〕。本研究的结果显示PAI-1在DM组中高表达，与大鼠24 h尿蛋白定量增加及肾脏ECM沉积的增加趋势相同，与文献报道一致，经过SS治疗可使肾脏ECM沉积减少及大鼠24 h尿蛋白定量降低，与PAI-1的表达下降密切相关，表明SS可以通过下调肾小球PAI-1高表达改变肾脏功能。

FGF21主要在肝脏及骨骼肌中表达，大多数来自鼠类的动物实验表明，FGF21可以通过脂肪组织和胰腺减轻肥胖相关的高血糖及高脂血症，另外，FGF21对于饥饿和酮症也有重要的调节功能，尚无人类的体内实验资料，仅从几种人类细胞实验得出的结果显示，虽然目前被视为治疗2型糖尿病的新型潜在因素，但FGF21治疗糖尿病的确切机制尚未阐明〔8〕。生酮饮食可以间接诱导小鼠肝脏FGF21表达增加并降低肾脏组织PAI-1表达〔3〕，这是目前唯一FGF21影响PAI-1表达的依据。本实验结果表明，DM组大鼠肝脏组织中的FGF21 mRNA表达增加，是高血糖及肥胖在疾病初期刺激的结果。FGF21基因表达上调在发挥降脂及降糖作用的同时，尚不能单独阻止肾小球中PAI-1基因的高表达。而SS治疗组大鼠中的FGF21 mRNA表达较DM组进一步升高，在更高的表达水平可以部分参与肾小球中PAI-1基因的表达下调，缓解糖尿病组大鼠的肾脏病理变化，FGF21与PAI-1基因表达在疾病后期呈负相关趋势。

本问题组前期研究结果显示，高山红景天主要有效成分SS(C14H20O7)除了具有抗氧化、抗衰老及双向免疫调节作用外，还可以降低阿霉素大鼠的尿蛋白定量、CHO水平，并且可以升高ALB水平〔9〕。而本研究的结果显示SS具有在降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平及尿蛋白定量等作用的同时，升高ALB水平，起到治疗DN的作用。同时观察到SS可以缓解糖尿病组大鼠的肾小球硬化，考虑与其对糖尿病肾小球硬化有决定性作用的PAI-1表达有一定程度的抑制作用有关，而SS对PAI-1高表达的抑制作用考虑有以下两种机制:(1)SS可以增加FGF21基因的表达，进而直接降低PAI-1在肾脏的表达水平;(2)SS治疗糖尿病大鼠引起FGF21进一步上调，通过其降低血糖及血脂水平的作用间接影响PAI-1在肾脏中的表达。SS通过上述两种途径起到延缓肾小球硬化及保护肾脏功能的作用。由于目前研究资料有限，SS影响FGF21基因表达以调控肾小球中PAI-1基因变化的确切机制尚须进一步研究证实。

1 Soldatos G，Cooper ME.Diabetic nephropathy:important pathophysiologic mechanisms〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2008;82(1):S75-79.

2 Huang Y，Border WA，Yu L，et al.A PAI-1 mutant，PAI-1R，slows progression of diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2008;19(2):329-38.

3 Oishi K，Uchida D，Ohkura N，et al.Ketogenic diet disrupts the circadian clock and increases hypofibrinolytic risk by inducing expression of plasminogen activator inhibitor-1〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009;29(10):1571-7.

4 黄凤霞，丁亚杰，王庆国，等.高山红景天甙对阿霉素肾病大鼠的影响〔J〕.中华肾脏病杂志，2005;21(7):412.

5 Xu ZG，Yuan H，Lanting L，et al.Products of 12/15-lipoxygenase upregulate the angiotensin Ⅱ receptor〔J〕.J Am Soc Nephrol，2008;19(3):559-69.

6 Najafian B，Alpers CE，Fogo AB.Pathology of human diabetic nephropathy〔J〕.Contrib Nephrol，2011;170:36-47.

7 Małgorzewicz S，Skrzypczak-Jankun E，Jankun J.Plasminogen activator inhibitor-1 in kidney pathology(Review)〔J〕.Int J Mol Med，2013;31(3):503-10.

8 Rydén M.Fibroblast growth factor 21:an overview from a clinical perspective〔J〕.Cell Mol Life Sci，2009;66(13):2067-73.

9 韩洪波，马铭泽，陈 韬.高山红景天对阿霉素肾病大鼠肾脏病理作用研究〔J〕.中国实验诊断学，2012;16(9):1601-2.