SIRT1高表达在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的神经保护作用1）

司沛沛，孙雪菲，杨小荣，张 策

谷氨酸是中枢神经系统中重要的神经递质，在胚胎期神经发育、脑的兴奋性突触传递、突触可塑性方面发挥了重要作用。但是，谷氨酸过度聚集可引起细胞损伤甚至死亡，称为兴奋性神经毒，兴奋性神经毒模型是最常用、最具毒性、损伤机制最复杂、最具临床意义的一个神经损伤模型，它参与多种神经病理过程，如脑缺血损伤、各种神经退行性疾病等［1，2］。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是哺乳动物中第一个被发现的去乙酰化酶Sirtuin蛋白家族成员，作为一种NAD＋依赖的脱乙酰基酶，它与组蛋白乙酰基酶共同维持细胞核的乙酰化平衡。SIRT1以组蛋白和多种非组蛋白作为底物，通过其去乙酰化作用调节基因转录、染色体稳定性和靶蛋白活性，进而参与能量代谢、细胞周期、细胞衰老及肿瘤发生发展等生理病理过程的调节。近年来，有关SIRT1的神经保护作用受到越来越广泛的关注。为进一步验证SIRT1可能具有的广泛的神经保护作用，本研究拟采用NMDA诱导的兴奋性神经毒细胞模型，应用（cell counting Kit－8）CCK－8分析、乳酸脱氢酶（LDH）检测、Western－blot等方法，明确SIRTI高表达在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SH－SY5Y人神经母细胞瘤细胞，购自上海中国科学院细胞库；胎牛血清购自Gibco公司；NMDA试剂购自sigma公司；CCK－8购自Dojindo；Lipofectamine 2000转染试剂、Opti－MEM无血清培养基购自Invitrogen公司；MEM、F12培养基，Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；质粒提取试剂盒购自全式金生物有限公司；兔抗人SIRT1抗体购自Abcam公司；β－actin山羊抗兔二抗购自中杉金桥；Super ECL Plus超敏发光液购自普利莱基因技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH－SY5Y培养基为 MEM、F12，含有10%胎牛血清，100U／mL青霉素、100U／mL链霉素。将细胞以1×105的细胞浓度接种于孔板或培养瓶中，培养于37℃，5%CO2条件下，每3天以1∶2传代一次。

1.2.2 NMDA毒性诱导 采用 NMDA（500μmol／L）和甘氨酸（10μmol／L）共孵育2h，更换培养基继续培养10h，再进行后续的CCK－8、LDH测定以及蛋白提取。

1.2.3 质粒转染 按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒后，利用脂质体介导的方法将其转入SH－SY5Y细胞中。细胞培养24 h后进行转染，质粒和lipo2000以1∶2.5混合后，加入无血清无双抗培养基中，培养6h后更换为全培养基，继续培养24 h～36h，转染效率达到最高。

1.2.4 CCK－8的测定 将培养在96孔板中的细胞在转染24h后，加入NMDA进行毒性诱导，继续培养12h，然后每孔加入CCK－8 10μL，37℃避光培养2h，上酶标仪测定，检测波长450 nm，参比波长650nm。

1.2.5 乳酸脱氢酶释放检测 将培养在六孔板中的细胞转染24h后 ，加入NMDA进行毒性诱导，继续培养12h，收集细胞培养液进行LDH活性检测。

1.2.6 Western blot检测与分析 利用Commassie法测定蛋白浓度。用10%分离胶、5%浓缩胶进行SDS－PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜后，用0.3%明胶中室温封闭1h，加入一抗SIRT1（1∶5 000）、β－actin（1∶3 000）4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗（1∶3 000）室温孵育1.5h。洗膜后加入ECL超敏发光液，曝光拍照，用分子生物学图像分析系统进行定量。β－actin条带作为内参。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件分析。数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 SIRT1蛋白水平的改变 Western blot结果显示，与正常组相比，SIRT1过表达组中SIRT1含量上调，增加1.15倍（P＜0.05）；空质粒组、lipo2000组未影响SIRT1的表达水平（P＞0.05）。详见图1。

图1 SIRT1表达水平的改变

2.2 SIRT1高表达对NMDA引起的细胞活力下降的作用将构建的SIRT1表达载体转入SH－SY5Y细胞中24h后，加入NMDA（500μmol／L）作用2h，继续孵育12h后采用CCK－8检测细胞活力。结果显示，而SIRT1高表达可有效抑制NMDA引起的细胞活力下降，使其活力恢复60.95%（P＜0.05）；与正常组相比，lipo2000、SIRT1组对细胞活力无统计学意义（P＞0.05）。详见图2。

图2 SIRT1高表达对NMDA引起的细胞活力下降的观察

2.3 SIRT1高表达对NMDA引起的LDH释放的作用 在LDH实验中发现，与对照组相比，NMDA组的LDH水平增高了59.45%（P＜0.05）；SIRT1高表达使NMDA诱导释放的LDH减少24.26%（P＜0.05）；lipo2000、SIRT1组对LDH 的释放无统计学意义（P＞0.05）。详见图3。

图3 SIRT1高表达对NMDA引起的LDH释放的作用

3 讨 论

谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质，当在突出间隙中过度积聚时，可以激活突出后膜NMDA受体，使胞外Ca2＋内流，激活多种蛋白酶，过度产生自由基，这些因素共同作用，引起神经元损伤甚至死亡，产生兴奋性神经毒效应［3］。

研究发现，热量限制（calorie restriction，CR）可以延长酵母及啮齿动物寿命，推迟哺乳动物年龄相关的疾病如癌症、动脉粥样硬化及糖尿病的发生，可能正是通过增加去乙酰化酶Sirtuin活性而起作用。这类蛋白修饰酶最初是在酵母中发现，被称为沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，Sir2）。随后，人们在哺乳动物体内也发现了具有广泛去乙酰化作用的Sir2编码蛋白。在哺乳动物基因组中，目前证实存在7种Sir2同系物（SIRTs 1－7），其中SIRT1是氨基酸序列最接近Sir2的同系物。SIRT1可能通过其去乙酰化酶活性参与调节物质代谢，如抑制糖酵解、维持血糖稳定、防止脂肪变性等。最新研究表明，SIRT1高表达后通过其去乙酰化作用，激活不同信号通路可防止心肌肥大，血栓形成以及血管平滑肌的肥大。

在多种神经损伤模型，如脑缺血性损伤模型、AD大鼠模型、HD小鼠模型、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和脊髓和延髓肌萎缩症（SBMA）模型，通过上调SIRT1增加其去乙酰化酶活性，发挥神经保护作用。在p25转基因鼠，SIRT1过表达可以显著对抗神经退行性病；在猴的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）动物模型中，高表达SIRT1能减少脑内的β淀粉样蛋白（amyloid－β，Aβ），且脑内 Aβ含量与同一区域的 SIRT1含量呈负相关［4］。随后离体、在体PD模型中发现，过表达SIRT1可促进α－synuclein蛋白降解，减缓神经变性［5］。Parker和他的同事们已在线虫中证明，过表达SIRT1可以抑制HTT突变引起的神经元死亡［6］；在转基因小鼠HD模型中，将SIRT1过表达可以使小鼠的运动协调能力得到显著改善，并减轻外周神经及纹状体神经元的损伤［7，8］。将SIRT1基因转染至原代神经元，发现过表达SIRT1可以拮抗由SOD1突变引起的神经毒性作用。SIRT1高表达在多种疾病损伤模型中可发挥神经保护作用。本实验中利用NMDA诱导的兴奋性神经毒模型，观察SIRT1高表达在NMDA诱导的细胞损伤中的作用。谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的神经递质，当在突出间隙中过度积聚时，可以激活突出后膜NMDA受体，使胞外Ca2＋内流，激活多种蛋白酶，过度产生自由基，这些因素共同作用，引起神经元损伤甚至死亡，产生兴奋性神经毒效应。在实验中，利用脂质体lipo2000介导的方法将质粒转入细胞中，加入NMDA诱导损伤，采用CCK－8、LDH检测发现，SIRT1高表达可以拮抗NMDA神经毒性损伤，表现为细胞活力增加，LDH释放减少。

而上述保护效应由SIRT1对底物P5 3、FOXOs、Ku7 0、PGC－1α、TAFI68、P300、PCA 等 的 去 乙 酰 化 作 用 介 导 的［9，10］。相应实验观察显示，SIRT1可以通过使P53去乙酰化，从而负性调节其活性，使细胞免于凋亡，继续分裂生长；SIRT1通过使凋亡激活蛋白FOXOs去乙酰化而抑制其转录，使神经元免于凋亡［11］；SIRT1可以使NF－κB亚基p65的赖氨酸310位点去乙酰化而降低其活性，防止细胞损伤；SIRT1通过使HSF1（heat shock factor 1，HSF1）去乙酰化，促进HSF1与Hsp70启动子结合，激活 Hsp70，减少细胞凋亡［12］。

本实验表明，在NMDA引起的神经毒过程中，SIRT1作用可能受到抑制，介导神经损伤，SIRT1高表达证实了可以拮抗NMDA引起的细胞损伤作用，发挥神经保护作用。但是，SIRT1具体的神经保护机制尚未明确，需要进一步研究证实。

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