蒙药材刺柏叶中槲皮苷的含量测定

崔鸿江，巴德玛，林 燕

1内蒙古医学院第二附属医院，呼和浩特 010030;2内蒙古自治区食品药品检验所，呼和浩特 010010

刺柏为柏科植物杜松(Juniperus rigida Si eb.Et Zucc.)的干燥嫩枝叶，为蒙医临床常用药，具清肾热、利尿、燥“协日乌素”愈伤止血等功效，主要用于治疗尿血、尿道疼痛、炭疽、风湿、肾“达日干”、“协日乌素”等病症［1］。该品种质量标准收载于《卫生部药品标准》蒙药分册，其中未规定含量测定项。为提高蒙药材质量标准，根据国家药典委员会专家的建议，对刺柏叶中主要活性成分之一槲皮苷，采用高效液相色谱法进行了含量测定研究，经实验条件摸索，结果达到了较好的液相色谱分离效果，方法简便，重复性好，可作为控制刺柏叶药材内在质量的有效方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

日本岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(带SPDM20A型二极管阵列检测器);Sartoriμs ME5型电子天平;Mettler AE-100电子天平;PL203型电子天平。

1.2 试剂与试药

槲皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号:111538-200302)，甲醇为色谱纯，其他均为分析纯试剂，水为离子交换高纯水。

1.3 供试样品

刺柏叶药材分别由内蒙古自治区锡盟蒙医研究所(1号)、内蒙古自治区中蒙医医院(2号)、内蒙古自治区阿拉善盟蒙医医院(3号)和内蒙古自治区锡林郭勒盟正蓝旗(4号)提供，经内蒙古自治区食品药品检验所康双龙、周凯两位国家药典委员会委员鉴定为柏科植物杜松(Juniperus rigida Si eb.Et Zucc.)的干燥嫩枝叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱

色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，本实验研究采用Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱和Shim-Pack C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱。

2.1.2 流动相的选择

参照《中国药典》［2］“侧柏叶”含量测定项下的方法，采用甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸(40∶60∶1.5)作为流动相，分离效果好、保留时间适中，流速:1.0 mL/min。在选定条件下，槲皮苷峰与样品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5;按槲皮苷峰计算，理论塔板数在3000以上。色谱图见图1、2。

2.1.3 柱温

本实验对30℃和40℃柱温进行了考察，结果保留时间略有差异，但分离度及理论板数没有变化，从资源角度考虑，故本实验研究将柱温定为30℃。

2.1.4 检测波长的选择

取槲皮苷对照品溶液，通过二极管阵列检测器对槲皮苷自200～800 nm进行光谱扫描，结果槲皮苷在255 nm处有吸收峰，结合《中国药典》2010年版一部“侧柏叶”含量测定项下的条件，故选择254 nm作为检测波长。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品适量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过2号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，加热回流45 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

取槲皮苷对照品2.010 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2、5、10、15、20、30 μL 注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积对进样量进行回归分析，绘制标准曲线，其回归方程为:Y=2776.56X+3349.05，r=0.9998。结果表明:在上述色谱条件下，槲皮苷进样量在40.2 ng～603.0 ng范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取同一地区的供试品(1号样)6份，各约0.4 g，精密称定，分别按上述供试品溶液的制备和色谱条件进行测定，进样量各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定每份含量，求得槲皮苷平均含量为2.23 mg/g，结果 RSD为0.12%，表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取刺柏叶供试品(1号样)6份样品，按供试品溶液制备方法操作，每份进样2次，每次进样量为20 μL，计算槲皮苷的含量及相对标准偏差，结果RSD为1.82%，表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

取同一供试品(含槲皮苷2.23 mg/g)6份，各约0.1 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入对照品溶液10 mL(槲皮苷浓度为0.02216 mg/mL)，再分别精密加甲醇10 mL，按上述供试品溶液的制备和色谱条件进行测定，试验结果表明，槲皮苷平均回收率为 100.45%(n=6)，RSD 为 0.69%。说明该测定方法测定结果准确。回收率试验结果见表1。

2.7 耐用性试验

2.7.1 色谱柱的考察

换不同厂家、不同型号的色谱柱，按确定的色谱条件，取精密度试验中的同一份供试品溶液进行测定，平均含量分别为:2.232 mg/g 和 2.139 mg/g，相对偏差为2.12%。结果表明，该方法对不同型号的色谱柱有较好的耐用性。

表1 槲皮苷加样回收率试验Table 1 Results of recovery tests

2.7.2 稳定性试验

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，然后每隔6 h测定1次，考察24 h，再于48 h考察1次。结果表明，对照品和供试品溶液至少在48 h内测定结果稳定，槲皮苷对照品峰面积的 RSD为0.23%(n=6)，供试品中槲皮苷峰面积的RSD为0.38%(n=6)。

2.8 样品的含量测定

取4批样品各0.2 g，精密称定，照供试品溶液制备项下操作，制成供试品溶液。在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪测定，并计算各样品中槲皮苷含量(按干燥品计算)。测定结果见表2。

表2 样品中槲皮苷的含量测定结果Table 2 Quantification results of quercitrin in samples from different sources

3 讨论

3.1 测定方法的选择

蒙药材刺柏叶的质量标准收载于《卫生部药品标准》蒙药分册，其中未规定含量测定项，检测项目无法满足目前的质量控制要求，因此，为进一步提高蒙药材的质量标准，根据国家药典委员会的建议，我们首次对该品种进行了高效液相色谱法的研究，结果达到了较好的液相色谱分离效果，方法简便，重复性好，可作为控制刺柏叶药材内在质量的有效方法。

3.2 提取溶剂的选择

文献报道［3］槲皮苷溶于乙醇，碱性水溶液，几乎不溶于冷水、乙醚中，曾使用甲醇、乙醇作溶剂进行提取，结果均可检出槲皮苷成分，而用甲醇作为提取溶剂，易过滤，干扰成分少，结合《中国药典》“侧柏叶”含量测定项下的方法，本实验选择甲醇为提取溶剂。

3.3 提取效率考察

本实验分别考察回流提取时间为20、30、45、60、90、120 min六个不同提取时间点对含量结果的影响，结果显示回流提取时间45 min时含量达到最大值，再继续回流提取，含量基本不再增加，为了节约能源，提高实验效率，故本实验选择回流提取时间为45 min。

3.4 指标成分的选择

选择具有抗病毒作用的槲皮苷［3］，作为含量测定的指标成分，采用HPLC测定其含量，方法简便，结果准确，稳定性好，可有效控制蒙药材刺柏叶的内在质量。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Drug Standard of Ministry of Health of the People's Republic of China《中华人民共和国卫生部药品标准》Mongolian Medicine Volume(蒙药分册).Beijing:Chemical Industry Press，1998.23.

2 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010，I:200.

3 State Administration of Traditional Chinese herbal medicine Information Center station(国家医药管理局中草药情报中心站).Herbal effective ingredients manual(植物药有效成分手册).Beijing:People's Health Press，1986.877.