缺硼对绿豆叶片光合特性和碳水化合物含量的影响

焦晓燕，王劲松，武爱莲，2，赵瑞芬，王立革，董二伟

(1山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西太原030006;2山西省农业科学院高寒作物研究所，山西大同037008)

我国缺硼土壤面积达3280万公顷，占耕地面积的34.5%［1］，其主要分布在北方的黄土、黄河冲积物发育的土壤上以及南方的红壤区。缺硼影响作物产量、品质及代谢［2－4］，原因可能是由于硼直接影响植物叶片的光合同化能力(即直接影响光合代谢)。缺硼植物叶片叶脉间失绿的现象也可能与因叶片碳水化合物积累而导致叶绿体降解有关［5］;缺硼时叶片较厚，叶片内细胞间的空间比较小［6］，这会妨碍CO2从气孔传导到叶肉细胞［7］，从而影响CO2的同化率。植物缺硼会造成光合速率(Pn)和气孔传导率(Gs)降低，胞间 CO2浓度(Ci)减少［8］，因此缺硼时叶片气孔关闭，光合速率较低，严重缺硼可导致叶绿素含量和蛋白质含量较低，并伴随低的电子传导率［9］。缺硼时植株的总光合速率降低不等于说缺硼对植物生长的影响是由碳水化合物的缺乏所造成的。目前根据已有的研究还不清楚缺硼是否直接影响植物的光合进而影响植物生长，或缺硼本身首先限制植物生长，进而降低光合速率。如果缺硼直接影响植物的光合作用的话，尽管有研究表明缺硼影响叶片胞间孔隙［6］，但对缺硼如何影响光合、气孔传导率和光合代谢过程的机理还不清楚。本文旨在探索叶片生长过程中硼对叶绿素含量、二氧化碳同化率和碳水化合物的影响，以探明这些症状是否是缺硼的直接或间接原因，为作物缺硼的生理机制研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和生长条件

鉴于以前的试验表明绿豆能够较好地反映缺硼症状［5］，本试验以绿豆作为指示植物。绿豆种子首先播种于蛭石中，约2d出苗，此时幼苗只供给蒸馏水，并且连续光照，光照强度为100 μmol/(m2·s)。待播种后5 d将幼苗移栽到含有Rorison，s的营养液中，白天控制温度为25℃，晚上18℃，每天光照18 h、光照强度350 ±20 μmol/(m2·s)。每2 d换一次营养液，在第二片真叶出现之前一直供给0.2 μmol/L硼，之后一半植株供给0.2 μmol/L硼(低硼)，另一半供给50 μmol/L硼(高硼)，在该试验中将此时定义为0 d。第二片真叶是在子叶完全脱落之后出现，其生长完全依赖于外源硼养分，故用第二片真叶的中间叶片作为本试验的研究对象。叶片面积用叶面积仪测定，根和茎在80℃下烘干至恒重。

1.2 叶绿素和碳水化合物含量的测定

可溶性碳水化合物和叶绿素用80%HEPES酒精缓冲液(pH 7.4)，在70℃下浸提30 min，重复上述过程，直至叶片变为无色为止。混合上述浸提液，用分光光度计和酶联测定法分别测定叶绿素［10］和可溶性糖的含量［11］。残余叶片用酶降解后，直接测定葡萄糖含量，用以表示淀粉含量。

1.3 光合速率和蒸腾的测定

在试验处理的第4、7、11、15和20 d时，在大气CO2浓度下测定绿豆叶片的净光合速率(Pn)，测定条件为:温度 25℃，光强(PAR)350 ±20 μmol/(m2·s)。为了了解Pn和PAR之间的关系，于硼处理后的第12 d和13 d，在大气CO2浓度、叶片温度保持在22 ±1℃以及 PAR为39～649 μmol/(m2·s)的条件下测定绿豆叶片的Pn。为了解Pn和CO2浓度之间的关系，在硼处理后的第14 d和15 d，在饱和光照条件(LSP)即光强为 640 μmol/(m2·s)时测定不同 CO2浓度下的 Pn，CO2浓度用气体控制仪进行控制。Pn与PAR和胞间CO2浓度(Ci)之间适合于下列关系:

式中:Pn为净光合速率，x为光照强度或Ci，用微积分(Sigmaplot 9.0)求得a、b和c值。最大净光合速率(Pnmax)为a+c，光合量子效率(Φ)是该曲线的斜率。同理可由Ci和Pn的关系求出饱和CO2的净光合速率(Pnsat)和羧化效率(d Pn/d Ci)。

1.4 气孔限制率和叶肉细胞对光合速率的限制率

气孔限制率(Ls)根据 Farquhar和 Sharkey［12］计算:

式中:Pn0为CO2扩散的抗性为零时的光合速率(Ci=Ca);Pn为当Ca为大气CO2浓度时Ci情况下的光合速率。

叶肉细胞限制率(Lm)根据 Jacob和 Lawor［13］提出的下列公式计算:

式中:Pns是在一定Ci情况下，对照植物的光合速率;Pnd是在相同Ci的情况下，缺硼植物的光合速率。在该情况下假设对照的Lm为零。

1.5 数据处理

所有数据用Minitab 14软件进行统计分析，用两尾 t检验法检验两处理间的显著性差异，用Microsoft Excel(2003)做图，图中数据表示为平均值(mean)± SE。

2 结果与分析

2.1 硼对植物生长的影响

供给植物不同浓度的硼4 d后，0.2 μmol/L B处理植物根生长开始受到影响;7 d后，新叶叶脉间开始失绿;20 d时植物仅有3～4片真叶，而生长在50 μmol/L B溶液中却有6片真叶。从12 d开始，0.2 μmol/L B处理植物的干物质积累显著低于高硼处理(P＜0.05)(图1A)，同时叶面积也明显减少(P＜0.05)(图1B)。

图1 硼对植物生物量(A)及第二三复叶中心叶片面积(B)的影响Fig．1 Effects of boron on plant dry weight(A)and the expansion(B)of the central leaflets of the second trifoliate leaves

2.2 硼对叶片叶绿素含量和光合速率的影响

在试验处理前15 d，低硼处理植株叶片的叶绿素含量与高硼处理基本一致(P＞0.05)。随着时间延长，高硼处理叶片中的叶绿素含量还在不断增加，而低硼处理叶片中的叶绿素含量却下降，在20 d时，低硼处理导致叶片中叶绿素含量明显低于高硼处理(P＜0.05)(图2A)。然而，在叶片生长发育前期，虽然硼对叶片中的叶绿素含量影响不大，但缺硼明显降低了植株的光合效率(图2B)。

图2 硼对叶绿素含量(A)及光合速率(B)的影响Fig．2 Effects of boron on chlorophyll content(A)，photosynthetic rate(Pn)(B)of the central leaflets of the second trifoliate leaves

2.3 硼对叶片气体交换和光响应的影响

通过测定绿豆叶片净光合速率(Pn)与光强(PAR)的关系，可明确饱和光合速率时的PAR值，且能判断核酮糖－1，5二磷酸(RuBP)的再生能力和核酮糖－1，5二磷酸羧化酶(Rubisco)的活性。在低光照时，Pn受RuBP再生能力的限制，在强光照情况下，其受Rubisco活性的影响［14］。与高硼处理叶片比较，在低光照条件下低硼对Pn没有影响(图3A)。低硼对Φ值也没有显著的影响(表1)。然而，当PAR增至185 μmol/(m2·s)以上时，低硼处理植株的Pn显著低于对照(P＜0.05)，植株的Pnmax也明显低于对照(表1)。

气孔开张受光照［15］和 CO2浓度的影响［16］。低硼明显降低了叶片的Gs(图3B)。通常光合速率和气孔开张程度会调节Gs值，气孔开张程度小，会导致Ci值降低。在该试验中，尽管低硼处理降低了绿豆叶片的Gs，但对Ci没有任何影响(图3C)，气孔调节Ci使低硼处理的植株与高硼处理植株的Ci值相当。

图3 硼对不同光照强度下净光合速率(A)、气孔传导率(B)和胞间二氧化碳浓度(C)的影响Fig．3 Net photosynthesis rate(Pn)(A)，stomatal conductance(Gs)(B)，internal CO2concentration(Ci)(C)of the second trifoliate leaves under different PAR

表1 硼对净光合速率与光照曲线衍生参数的影响Table 1 Effects of boron on photosynthetic parameters derived from photosynthesis rate versus irradiance curves

2.4 缺硼对光合速率与外界CO2浓度(Ca)和胞间CO2浓度(Ci)反应的影响

为了明确在缺硼条件下是因羧化效率还是RuBP再生能力影响光合效率，以及进一步清楚缺硼是否影响气孔开张或叶肉细胞光合能力，进而研究了Pn与Ca或Ci的关系。在任何Ca的情况下，低硼植物叶片的Pn值均低于对照处理，但在Ca为39.30±0.67 μmol/mol时，低硼处理植株叶片Pn值为高硼处理的30%;当Ci值增至900 μmol/mol时，低硼处理植株的Pn是对照处理的87.5%(图4A)。因此，随着Ca值的增加，低硼对Pn的影响降低。不论是低硼还是高硼处理，光合速率与Ci的关系类似于与Ca的关系(图4B)。

由Pn与Ca和Ci反应曲线可以得到Ls和Lm值(表2)。尽管在任何光照强度条件下，低硼处理植株和高硼处理的Ci值一致，但缺硼植株的Ls是高硼处理植株的两倍。若假设高硼处理的植株是最佳叶肉状况(即Lm=0)，可以计算出低硼处理植株的Lm值。随Ci值的增加，低硼处理植株的Lm降低。而且低硼处理植侏的dPn/dCi值显著低于对照处理，但CO2饱和时的植株叶片净光合速率(Pnsat)接近于对照处理，且两者之间无显著差异(P＞0.05)。

虽然低硼降底了绿豆叶片的Ls值，但在任何Ca情况下低硼处理植株的Ci值几乎与对应的高硼处理一致(图4C)，表明低硼并未影响CO2从大气扩散至叶片内部。

图4 硼对不同叶室CO2浓度(Ca)(A)和胞间CO2浓度(Ci)(B)光合速率(Pn)的影响及其叶室CO2浓度(Ca)(A)和胞间CO2浓度(Ci)的对应关系(C)Fig．4 Effects of boron on the responses of photosynthetic rate(Pn)to external CO2concentration Ca(A)and internal CO2concentration(Ci)(B)，and the relationship between external CO2concentration(Ca)and internal CO2concentration(Ci)(C)of the central leaflets of the second trifoliate leaves

表2 硼对CO2同化率与胞间CO2浓度(Ci)和外界CO2浓度(Ca)曲线衍生参数的影响Table 2 Effects of boron on photosynthetic parameters derived from photosynthesis rate versus either internal CO2concentration(Ci)or external CO2concentration Ca curves

2.5 缺硼对叶片中碳水化合物含量的影响

从图5可以看出，低硼处理对植株葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉有一定影响，虽然低硼抑制了植株叶片的Pn，但提高了碳水化合物含量。在处理后11 d，低硼处理植株葡萄糖含量增加4倍(图5A)，果糖含量差异不大(图5B)。在生长过程中高硼处理叶片蔗糖含量稳定，缺硼植株蔗糖含量从处理的11 d到20 d突然增加(图5C)，处理20 d后，其蔗糖含量是高硼处理植株的6倍(P＜0.05)。在开始到11 d，低硼植株的叶片中淀粉含量增加，从11 d到20 d淀粉含量没有变化(图5D)，高硼处理植株叶片中的淀粉含量一直呈增长状态。

3 讨论与结论

本文调查了绿豆叶片生长过程中，硼对叶绿素含量、气体交换特征和碳水化合物含量的影响。在前15 d内，缺硼对叶绿素含量没有影响，第20 d时缺硼降低了叶绿素含量(图2A);缺硼抑制了植株的净光合速率(Pn)(图2B)，但该影响早于对叶绿素的影响;所以硼并不是通过影响叶绿素含量来影响光合速率。通常在逆境环境下通过影响气孔开张或叶肉细胞光合能力(即羧化和电子转移)来影响CO2同化率。本试验研究得出如下结论:

图5 硼对叶片葡萄糖(A)、果糖(B)、蔗糖(C)和淀粉(D)含量的影响Fig．5 Glucose content(A)，fructose content(B)，sucrose content(C)and starch content(D)of the central leaflets of the second trifoliate leaves under B 50 and B 0．2 μmol/L treatment

第一，缺硼时CO2同化率的降低伴随着Gs的降低(图3B)，这与以前的研究结果相一致。Sharma和Ramchanra［17］认为，缺硼影响气孔密度和气孔的开张度，从而降低CO2的传导率和Ci值，因此认为缺硼时光合效率低是由于气孔对CO2传导施加阻力的结果，但本研究结果并与此结论不一致。首先，尽管缺硼植物的 Gs低(图3B)，气孔小［6］，但在所有光照强度下缺硼对Ci值没有影响(图3C);其次，在任何大气CO2浓度(Ca)情况下，缺硼植株和高硼处理植株的Ci值相一致(图4C)。这都表明，缺硼对Ci没有影响。气孔起着调节CO2进入叶片并限制蒸腾的作用［18］。结果表明，缺硼植株的Gs降低是由于其具有与高硼处理植株相同的Ci值，因此认为缺硼并不是通过影响Gs来影响光合效率的。

第二，缺硼导致Ls值高于对照(表2)，似乎这与上述讨论的硼不影响Ci值相矛盾，这可能是由于在计算时将CO2内部扩散抗性忽略不计［12］的原因;通常情况下在羧化位置的 CO2浓度与 Ci相一致［12］，但实际上有时内部扩散的阻力也比较大，因而会导致在羧化位置的 CO2浓度与 Ci值不一致［19］。由于叶肉细胞抗性与叶片解剖结构和叶片厚度有关［7］，缺硼植物的叶片细胞间狭小，细胞排列紧密［6］，这样缺硼植株叶片中的CO2传导抗性比较高，因此虽然缺硼植株与高硼处理的植物具有相同的Ci值，但缺硼植株内羧化位置的CO2浓度低于高硼处理。如果是这样，缺硼不应该影响Ls;同时因与对照比较，硼影响了叶片内CO2的传导抗性，因此有必要谨慎解释缺硼对Ls的影响。

第三，硼对光合量子效率(φ)没有影响(表1)，说明硼对光合系统中电子传导没有影响;另外，缺硼植物与高硼处理植物具有相同的Pnsat，表明足够的CO2浓度可克服缺硼对CO2扩散抗性的影响(表2)。由于在低光照和高Ci条件下，CO2同化率受RuBP的再生能力的影响，表明缺硼不影响RuBP的再生能力，从而说明缺硼与否对同化能力没有影响，但缺硼降低了Pnsat和 dPn/dCi(表1，图3A)。根据von Caemmerer ＆ Farquhar［20］的观点，缺硼植物的Rubsico活力低于对照，但是所有这些观点均建立于内在扩散抗性为零和不受处理影响的条件下。因此在缺硼条件下，较低的dPn/dCi值可能是由于内在CO2扩散抗性增高的原因，或至少低估了在缺硼植物中的羧化效率。在高光照条件下，缺硼对同化速率的影响高于低光照(图3A);随着Ci值的增加，缺硼叶片Lm降低(表2)，同样，缺硼对光合能力的影响至少部分地来源于在羧化位置的CO2缺乏。

第四，硼可能通过多种途径调节光合速率，但缺硼通常导致碳水化合物的积累(图5);尽管缺硼时标记的碳水化合物运输受到影响［21］，植株硼效率差异也会影响硼糖络合物形成进而影响碳水化合物的运输［22］，但此前郑伟等［23］研究表明，缺硼植株叶片中半纤维素和木质素含量增加，本研究结果表明缺硼引起绿豆植株叶片碳水化合物的累积，故缺硼时植物生长受到影响并非是碳水化合物缺乏造成的结果。所以硼并不是通过影响碳水化合物的运输而影响植物生长，相反，缺硼时植物生长受到抑制并伴随碳水化合物在叶片中的积累。本试验在绿豆生长的第4 d时缺硼对碳水化合物的含量没有影响(图5)，这可能是由于所产生的碳水化合物供给自身生长，在第11 d，缺硼时根和新叶的生长受到抑制时，碳水化合物(特别是庶糖)在其中积累，由于碳水化合物在植物体内的运输是由库和源之间的差异梯度来维持［24］，因此缺硼时碳水化合物在库中的积累也表明其在源中的积累，该观点进一步说明硼在分生旺盛的组织中起着关键作用，与Wang等［25］认为硼是细胞壁组成成分、缺硼影响细胞分化及生长发育的观点相一致。

第五，缺硼植物中碳水化合物含量增加，但光合速率降低，这可能是由于糖的积累反馈调控光合速率的缘故。

总之，缺硼影响光合同化速率，这可能是由于低度库活力和在羧化位置的CO2浓度;本试验未观察到缺硼对叶绿素含量的影响，可能是碳水化合物积累的结果;硼不影响RuBP的再生能力，表观上缺硼影响羧化效率(dPn/dCi);鉴于硼影响植物叶片结构［5］，本研究很难推断硼是否影响Rusico的活性，但至少说明缺硼抑制植物生长与降低了光合速率无关。

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