左氧氟沙星对豚鼠心肌细胞电生理的影响

韦迎娜 韩圣娜 张 朝 (海南农垦三亚医院心内科，海南 三亚 57000)

左氧氟沙星(LVFX)作为喹诺酮类药物最常用的代表药物，为氧氟沙星的左旋体，其抗菌活性约为氧氟沙星的2倍，它的主要作用机制为抑制细菌DNA旋转酶活性，抑制细菌DNA复制。具有抗菌谱广、抗菌作用强的特点，对多数肠杆菌科细菌，如肺炎克雷白菌、变形杆菌属、伤寒沙门菌属、志贺菌属、流感杆菌、部分大肠杆菌、铜绿假单胞菌、淋球菌等有较强的抗菌活性;对部分葡萄球菌、肺炎链球菌、衣原体等也有良好的抗菌作用。偶见纳差，恶心、呕吐、腹泻、失眠、头晕、头痛、皮疹及血清谷丙转氨酶升高及注射局部刺激症状等，一般均能耐受，疗程结束后即可消失。但临床上喹诺酮类药物对心脏不良反应的报道逐渐增多，本试验旨在从动物大体水平和细胞离子通道水平〔1〕观察LVFX对心脏的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 成年豚鼠(河南省实验动物中心提供)，体重(300 ±50)g，雌雄不拘。

1.2 豚鼠心电图的记录 用20%的乌拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉豚鼠。待麻醉稳定后，将豚鼠仰卧位固定，用针形电极插入豚鼠的四肢皮下。使用BL-410生理软件(成都泰盟科技有限公司)记录豚鼠Ⅱ导联心电图。经腹腔注射盐酸司帕沙星(SPX)50、100、200 mg/kg，分别记录注射 LVFX 后 15、30、45、60、120、360 min的心电图。测量心电图的RR间期、QT间期并计算校正的QT间期(QTc)，QTc=QT×RR－1/2;腹腔注射生理盐水作为对照组。根据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”，高剂量为200 mg/kg，中剂量为100 mg/kg，低剂量为50 mg/kg，每组5只。

1.3 豚鼠心室肌细胞的分离〔2〕在无麻醉的情况下迅速敲击头部致昏后，立即剖胸取出心脏，将跳动心脏置于4℃的无钙台氏液中洗去心腔中残留血液，立即将心脏悬挂于Langendorff装置上，并用动脉夹固定。首先用无钙台氏液进行主动脉逆行灌流;10 min后，换以含 Ca2+(0.025 mmol/L)、胶原酶(B型，0.37 g/L)和蛋白酶(XIV型，0.027 g/L)的低钙台氏液灌流10～15 min(液体温度保持 36～37℃，灌流速度为2～3 ml/min)。待心脏膨松变大，呈现半透明的粉红色，并且流出液为黏条状，再用高钾液(Glutamic acid 120，KOH 80，KCl 20，MgCl21，EGTA 0.3，HEPES 10，葡萄糖10 mmol/L)灌流10 ～15 min，冲洗残留的含酶液。取心室组织，置于室温的高钾液中剪成碎块，并用吸管缓慢地反复吹打使之分散。用200 μm微孔的尼龙网过滤除去结缔组织及未消化心肌组织块，滤液在室温静置约1 h，得到相对纯净的单个心室肌细胞。所用液体均预先充以纯氧达到氧饱和，室温保持在20～22℃〔3〕。

1.4 全细胞膜片钳电流的记录〔4〕取少许细胞悬液置灌流皿中，放于倒置显微镜的操作台上，以正常台氏液(NaCl 140，KCl 5.4，CaCl22，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖 10 mmol/L)持续灌流细胞(流速1 ml/min)。使用记录IK的电极内液，细胞外液中加入0.3 mmol/L CdCl2以阻断Ca2+电流。细胞膜维持电位为－40 mV，使钠通道和 T型 Ca2+通道失活。命令电压在－10 mV～+80 mV之间，电压阶跃10 mV，时程5 s，采样频率0.25 kHz，刺激间隔15 s，得到各个钳制电位下的IK电流值。

膜吸破后先记录正常的IK的电流曲线作为对照，随后，灌流液中加入 5 种不同浓度(1 ×10－7、1 ×10－6、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3mol/L)的 LVFX 20 min 后，观察用药后电流的变化。IK为上述实测电流值;细胞膜电容Cm的计算公式为Cm=τ×I/V，其中I(pA)是电容电流的幅值，τ(ms)是未补偿的电容电流衰减的时间常数，V(mV)为10 mV的恒定去极化脉冲。平均膜电容为(61.12±2.64)pF(n=120)，与文献〔5〕(31～136 pF)一致。绘制电容电流-电压关系曲线，观察去极化程度逐渐增大时，电容电流的变化规律。同时，取+50 mV去极化水平，测量不同浓度药物作用下，电容电流被抑制的百分率，然后绘制出药物作用的量效曲线。以浓度的对数为横坐标，加药前后的比值为纵坐标，根据公式IC50=〔D〕/(1－I/Imax)－〔D〕得出LVFX的量效关系(其中D为药物浓度)。

1.5 统计学方法 采用Oringin6.0软件进行t检验和方差分析。

2 结果

2.1 豚鼠心电图的改变 在注射200 mg/kg的LVFX时，豚鼠会出现不安、烦躁、呕吐，甚至逐渐昏迷等中毒症状。随着剂量的增加，LVFX引起QT间期延长也越明显。见图1。

图1 LVFX对豚鼠心电图QT间期的影响

在剂量为50、100 mg/kg时，LVFX引起QTc加药前后自身对照差异无显著性;当剂量为200 mg/kg时，LVFX引起的延长幅度差异显著(P＜0.05)。见表1。

表1 LVFX对豚鼠心电图R-R间期、QT间期、QTc的影响(±s，n=5)

表1 LVFX对豚鼠心电图R-R间期、QT间期、QTc的影响(±s，n=5)

与加药前比较:1)P＜0.05

浓度(m g/k g) 加药前(m s)R-R Q T Q T c R-R Q T Q T c Q T c延长幅度(%)加药后6 0 m i n(m s)生理盐水 2 0 2.1 5±1 2.2 1 1 0 1.1 0±1 1.4 5 2 1 3.1 4±1 1.6 7 2 0 4.3 2±1 2.3 7 1 0 2.8 7±1 4.2 3 2 1 5.3 5±1 2.0 3 1.0 4±0.1 1 5 0 1 8 7.2 1±6.6 2 9 8.4 4±5.1 5 2 1 4.3 4±5.8 3 2 0 5.0 2±8.6 0 1 0 7.6 2±4.7 5 2 3 8.1 3±5.9 8 5.1 1±2.0 2 1 0 0 2 1 1.2 2±8.3 1 1 0 5.2 0±6.5 0 2 1 5.9 6±6.7 7 2 0 9.2 0±1 5.2 8 1 1 7.5 6±7.2 2 2 6 0.3 2±7.5 7 9.1 0±1.3 0 2 0 0 2 1 1.6 1±1 1.2 5 1 0 2.4 2±2.5 0 2 3 3.9 9±9.0 0 2 5 0.4 2±1 5.1 1 2 7.6 4±3.6 6 2 6 3.7 5±4.5 6 1 4.5 4±0.6 9 1)

2.2 LVFX对豚鼠单个心室肌细胞 IK(IK，step;IK，tail)的影响脉冲电流(IK，step)为一外向电流，激活缓慢，无明显的失活，随测试电压去极化而逐步增大，呈时间依赖性和电压依赖性;当脉冲刺激停止，复极到－40 mV时出现明显的尾电流(IK，tail)，尾电流幅度较小，约为IK，step幅度的1/3。这些特征都符合IK电流的电生理特征。1×10－4mol/L的LVFX作用前、后，心室肌细胞的IK曲线的变化，LVFX作用后脉冲电流和尾电流均减小。+50 mV的测试电压水平下，1×10－4mol/L的LVFX作用20 min前后IK减小。见图2。

图2 LVFX(1×10－4mol/L)对豚鼠单个心室肌细胞IK电流的影响

图3可见明显的 I-V曲线下移，即对 IK(IK，step;IK，tail)均有抑制作用。但这种抑制作用不影响IK原有的时间依赖性(IK，step)和电压依赖性。几乎所有测试电压下LVFX作用后的IK均降低，且降低的程度随测试电压的去极化而增大，呈电压依赖性改变。

在测试电压为+50 mV时，LVFX的浓度分别为1×10－7、1 ×10－6、1 × 10－5、1 × 10－4、1 × 10－3mol/L，作用 20 min 后，IK，step依次从加药前的(2.14 ±0.26)、(2.85 ±0.31)、(2.76 ±0.26)、(3.75±0.91)、(5.07±1.24)pA/pF减小到了加药后的(1.88±0.24)、(2.46±0.32)、(2.25±0.31)、(2.24±0.61)、(3.26±0.96)pA/pF;其 IK，tail加药前依次为(1.19 ± 0.05)、(1.29 ±0.18)、(1.04 ±0.26)、(1.21 ±0.24)、(2.19±0.56)pA/pF;加药后依次为(1.12±0.07)、(1.14±0.16)、(0.86±0.22)、(0.95 ±0.17)、(1.18 ±0.35)pA/pF，可见LVFX对IK的抑制作用呈浓度依赖性。见表2。LVFX对IK的抑制呈浓度依赖性。见图4。

表2 LVFX对豚鼠心室肌IK(IK，step，IK，tail)的抑制率(%，n=5)

图3 LVFX豚鼠心室肌IK(IK，step;IK，tail)的I-V曲线

图4 LVFX对IK抑制的量效关系曲线

3 讨论

本实验说明，在低剂量LVFX使用比较安全，而随着剂量的增加，LVFX就有引起QT间期延长的潜在危险。心电图上QT间期反映了心室肌去极和复极的总时程，反映到动作电位上则主要是动作电位时程的改变，尤其是复极3期的改变。

本研究提示LVFX对IK的抑制作用是呈浓度依赖性的，但这种抑制作用不影响IK原有的时间依赖性和电压依赖性。这与文献报道〔7〕第三代氟喹诺酮类抗菌药LVFX等对人类ethera-go-go相关基因(HERG)电流密度的抑制作用呈浓度依赖性相一致。考虑为随LVFX浓度的增加，单位膜电容上被抑制的IK电流也随之增加，使动作电位复极过程中K+外流减少所致，但这种抑制作用不影响IK原有的时间依赖性和电压依赖性。本文说明LVFX有较强的阻断IK的作用，延长动作电位时程，诱发引起QT间期延长的现象。长QT综合征(LQTS)是一种先天遗传性，或者后天获得的心脏复极延迟的疾病。长QT综合征表现为心电图上QT间期延长，它可以引起室性早搏及尖端扭转性室速等致命性的心律失常，心源性晕厥和猝死为长QT综合征常见并发症。长QT综合征患者心电图上QT间期异常延长，临床上长QT综合征患者反复发生心源性晕厥、并常导致猝死的发生〔8〕。在临床的使用中，尤其在患者心衰并肺部感染，易出现血钾偏低情况，此时如果选用喹诺酮类药物〔9〕进行抗感染治疗，必须密切观察患者血钾情况，最高保证患者血清钾在4 mmol/L以上相对安全，有文献报道〔10〕，在严重的心肺疾病中，血钾低可导致严重的恶性心律失常，原因多为 QT间期延长导致频发间断扭转型室速，心室颤动最终导致死亡。因此，临床医生在对可引起长QT间期的药物重视，喹诺酮类药物就是在较大剂量是可引起长QT间期的一大类药物。

1 孙 亮，龙 村，黑飞龙，等.缺血再灌注处理对乳鼠心肌细胞钠电流的影响〔J〕.中国体外循环杂志，2011;9(1):28-31.

2 Molecot CO，BitoV，Argibay JA.Rutheniurn red as an effective blocker of calcium and sodium currents in guinea pig isolated ventricular heart cells〔J〕.Pharmacology，1998;24:465-72.

3 Xu YF，Dong PH，Zhang Z，et al.Presence of a calcium-activated chloride current in mouse ventricular myocytes〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002;283(1):H302-14.

4 Ahmmed U，Dong PH，Song GJ，et al.Changes in Ca2+cycling proteins underlie cardiac action potential prolongation in a pressure-overloaded guinea pig model with cardiac hypertrophy and failure〔J〕.Circ Res，2000;86:558-70.

5 Rubinstein E，Camm J.Carditoxcity of fluoroquinolones〔J〕.J Antimicrobial Chemother，2003;49:593-9.

6 黄 冬，李京波，魏 盟.胺碘酮对模拟缺氧状态下大鼠心室肌细胞瞬时外向和内向整流钾电流的影响〔J〕.中国心脏起搏与心电生理杂志，2007;27(4):345-9.

7 Bischoff U，Schmidt C，Netzer R，et al.Effects of fluoroquinolones on HERG currents〔J〕.Eur J Pharmacol，2000;406:341-3.

8 Priori S，Bloise R，Crotti L.The Long QT syndrome〔J〕.Europace，2001;3(1):16-27.

9 Moroz VM，Lipnitskii TN.Dysfunction of ionic channels in cardiomyocyte sarcolemma and cardiac arrhythmias〔J〕.，2006;43:101-8.

10 齐 鹏.急性心肌梗死早期低钾血症与恶性室性心律失常的关系〔D〕.河北医科大学，2010.