α-硫辛酸对卡那霉素致离体小鼠耳蜗毛细胞损伤的防护作用

王爱梅 许 涛 刘双月 牟 华 (辽宁医学院生理学教研室，辽宁 锦州 121001)

卡那霉素(KM)作为一种氨基糖苷类抗生素(AmAn)，具有严重的耳毒性副作用，可导致耳蜗毛细胞损伤。目前认为，KM的耳毒性机制与其促进氧自由基的过量生成并进而引发脂质过氧化反应有关。据此，国内外学者应用抗氧化剂来防护KM 的耳毒性〔1，2〕。α-硫辛酸(LA)是一种新型抗氧化剂，具有清除氧自由基、螯合铁离子等多种作用〔3〕，可有效防护庆大霉素对大鼠耳蜗毛细胞的损伤〔4〕。本文研究LA对KM所致离体培养小鼠耳蜗毛细胞损伤的防护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 生后3 d的昆明小鼠120只(240耳)，雌雄兼用，由辽宁医学院实验动物中心提供。硫酸KM粉剂购自美国Ameresco公司，LA、牛血清白蛋白(BSA)和TRITC-鬼笔环肽均购自美国Sigma公司，DMEM/F12培养基购自美国Invitrogen公司，Ⅰ型鼠尾胶购自中国杭州生友公司，基础Eagle培养基(BME)干粉、碳酸氢钠和Hanks液购自北京迈晨生物科技有限公司，SOD试剂盒、MDA试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 耳蜗基底膜取材 用75%乙醇喷洒小鼠全身进行皮肤表面消毒，断头后沿矢状缝剪开颅骨，去除脑组织以充分暴露颅底。体视显微镜下取出整个耳蜗并移入预冷的Hanks液中。打开耳蜗壳，依次剥离螺旋韧带、前庭膜及血管纹等结构，用游丝镊夹住基底膜底回末端，将基底膜沿蜗轴完整分离。

1.2.2 耳蜗螺旋器培养 预先在培养皿中滴入10 μl新鲜配制的胶原凝胶液(由Ⅰ型鼠尾胶、10×BME和2% 碳酸氢钠按9∶1∶1比例配制而成)，室温下放置15～20 min，待胶原凝胶液凝固后加入含1%BSA的DMEM/F12培养基1 ml。将分离后的每个基底膜平铺到凝胶表面。在37℃、5%CO2培养箱中培养4 h后，再加入1 ml培养基，使培养基完全覆盖凝胶，然后将培养皿放回培养箱中继续培养24 h。

1.2.3 实验分组及离体KM耳毒模型的制备 经培养24 h后，弃去原培养基。将基底膜随机分为6组，每组40条。其中A组为对照组，加入2 ml新鲜培养基;B组为KM组，加入2 ml含有0.3 mmol/L KM的新鲜培养基;C、D、E组为KM+LA组，分别加入2 ml含有0.3 mmol/L KM和不同浓度LA(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)的新鲜培养基;F组为LA组，加入2 ml含有1.0 mmol/L LA的新鲜培养基。各组均继续培养24 h后终止实验。每组随机选取10条基底膜用于TRITC-鬼笔环肽荧光染色，另外30条用于SOD活力和MDA含量测定。

1.2.4 TRITC-鬼笔环肽荧光染色 终止实验时吸出培养基，向培养皿中加入含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS溶液，4℃下固定过夜。PBS漂洗3次后取下带有基底膜的凝胶，浸入0.25%Triton X-100溶液中，室温下处理20 min。然后移入到TRITC-鬼笔环肽(1∶200稀释)溶液中，室温下避光染色30 min。PBS漂洗后将带有基底膜的凝胶移至滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，盖上盖玻片。荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞形态变化。

1.2.5 耳蜗毛细胞计数 将标本置于荧光显微镜下，选取0.17 mm标尺为一个视野，从基底膜顶端向底端连续观察毛细胞，并将毛细胞计数结果输入计算机，应用耳蜗毛细胞定量分析软件(KHRI Cytocochleograms，Version 3.0)，分别选取距离耳蜗蜗顶12% ～20%、44% ～52%、84% ～92%的三个区域，自动计算出毛细胞的缺失百分率。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量测定 终止实验时吸出培养基，PBS冲洗3次，每6条基底膜合成一份标本放入离心管中，每组5份标本。将标本于常温下超声粉碎30 s，1 000 r/min下离心8 min。分别取上清液0.05 ml，应用比色法和硫代巴比妥酸法分别测定耳蜗组织中SOD活力和MDA含量，同时用考马斯亮蓝法进行组织蛋白定量。SOD活力单位用nU/mgpro表示，MDA含量用nmol/mgpro表示。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件。数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验。

2 结果

2.1 TRITC-鬼笔环肽荧光染色 荧光显微镜下，可见TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在毛细胞的纤毛束。A组耳蜗毛细胞形态结构完好，外毛细胞(OHC)的纤毛呈典型的“V”字形排列，内毛细胞(IHC)的纤毛排列成“一”字形;B组耳蜗毛细胞出现纤毛倒伏、排列紊乱等形态改变，同时伴有毛细胞的大量缺失，尤其底回IHC、OHC均全部崩解，呈瘢痕状结构;C、D和E组耳蜗毛细胞的形态改变较KM组有所减轻，毛细胞的缺失亦比KM组显著减少，并且随着LA浓度的增大，其效应亦明显增强;F组耳蜗毛细胞纤毛排列整齐，无倒伏及融合，且毛细胞无缺失。见图1。

2.2 耳蜗毛细胞计数 与A组比较，B组耳蜗IHC、OHC缺失率均明显增大，差异有统计学意义(P＜0.05)。C、D和E组耳蜗IHC、OHC缺失率较B组明显减小，差异有统计学意义(P＜0.01)，并且随着LA浓度的逐渐增大，耳蜗底回IHC、OHC缺失率亦逐渐减小，呈明显的量效关系，且各剂量间差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01);F组与A组比较无显著差异。见表1和表2。

表1 各组耳蜗IHC缺失率(%，±s，n=10)

表1 各组耳蜗IHC缺失率(%，±s，n=10)

与A组比较:1)P＜0.05;与B组比较:2)P＜0.01;与C组比较:3)P＜0.05;与D组比较:4)P＜0.01，下表同

组别12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.31±0.41 0.32±0.48 0.67±0.48 B 16.10±9.561) 57.62±4.161) 94.50±1.811)C 0.53±1.062) 8.31±4.201) 30.91±7.872)D 1.42±1.652) 6.61±4.241) 10.09±3.782)3)E 0.93±0.932) 4.06±2.612)3) 5.16±3.592)3)4)F 1.24±0.92 1.39±0.68 1.11±0.73

表2 各组耳蜗OHC缺失率(%，±s，n=10)

表2 各组耳蜗OHC缺失率(%，±s，n=10)

组别12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.36±0.52 0.32±0.48 0.67±0.48 B 23.30±6.761) 65.13±8.541) 94.90±0.891)C 1.08±1.532) 9.18±1.272) 42.85±4.302)D 1.43±1.412) 8.39±0.862) 27.94±6.032)3)E 1.08±0.772) 3.73±1.422)3) 6.97±2.192)3)4)F 1.04±0.80 1.08±0.97 0.84±0.46

2.3 LA对小鼠耳蜗组织中SOD活力和MDA含量的影响 B组耳蜗组织中SOD活力明显下降，MDA含量则明显增多，与A组比较有显著性差异(P＜0.05)。C、D和E组耳蜗组织中SOD活力较B组明显增强，而MDA含量则较B组明显减少(P＜0.05)，并且呈明显的量效关系。F组耳蜗组织中SOD活力明显高于A组(P＜0.05)，MDA含量则较A组无明显差异。见表3。

表3 不同浓度LA对小鼠耳蜗SOD活力和MDA含量的影响(±s，n=5)

表3 不同浓度LA对小鼠耳蜗SOD活力和MDA含量的影响(±s，n=5)

组别 SOD(nU/mgpro) MDA(nmol/mgpro)A 46.21±1.25 3.23±0.15 B 22.54±1.141) 9.43±0.311)C 28.86±1.602) 6.07±0.062)D 35.04±0.632) 5.37±0.152)E 39.42±1.912)4) 4.60±0.102)4)F 56.02±1.511)3.08±0.08

3 讨论

研究表明，AmAn可与铁离子形成复合物，该复合物具有氧化还原活性，能活化氧分子，生成过量的超氧阴离子自由基(O－2)〔1〕。O－2不仅可直接破坏细胞内蛋白质、核酸等生物大分子，而且还能派生出羟自由基、过氧化氢等其他毒性分子，从而加重对机体的损害。此外，O2－及其派生物还可引发细胞生物膜上的脂质过氧化并因此生成过多的脂质过氧化物。SOD能清除O－2，保护细胞免受损伤，其活力高低可间接反映机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化物在机体内的代谢终产物，其含量多少可反映机体内脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤程度。本研究表明KM对离体培养的小鼠耳蜗毛细胞造成损伤。氧自由基及其引发的脂质过氧化反应参与了KM对离体小鼠耳蜗毛细胞的损伤。

LA是一种二巯基化合物，可直接与铁离子螯合成亲脂性复合物，从而抑制铁离子催化的花生四烯酸氧化，以减少O－2的产生，阻止细胞发生脂质过氧化〔5〕，是目前已知天然抗氧化剂中效果最强的一种。在体实验表明，LA能有效减轻庆大霉素对大鼠耳蜗毛细胞的损害〔4〕。此外，LA亦对噪声暴露下大鼠的耳蜗损伤和毛细胞缺失具有防护作用〔6〕。最近研究显示，LA可通过抑制耳蜗内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3(NOX3)的表达，以减少活性氧的生成，从而有效防护顺铂所致大鼠听力丧失〔7〕。本研究说明LA在离体情况下能有效防护KM对小鼠耳蜗毛细胞的损伤，能有效提高SOD活力，以清除过量的O－2，进而减少脂质过氧化物及代谢终产物MDA的生成，保护小鼠耳蜗毛细胞免受KM的毒性破坏。

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2 Jiang H，Sha SH，Schacht J.NF-κB pathway protects cochlear hair cells from aminoglycoside-induced ototoxicity〔J〕.J Neurosci Res，2005;79(5):644-51.

3 Ghibu S，Richard C，Vergely C，et al.Antioxidant properties of an endogenous thiol:alpha-lipoic acid，useful in the prevention of cardiovascular diseases〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2009;54(5):391-8.

4 袁 波，姜学钧，赵慕兰，等.α-硫辛酸对庆大霉素所致大鼠耳毒性损害的保护作用〔J〕.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2009;17(4):185-8.

5 Suh JH，Moreau R，Heath SH，et al.Dietary supplementation with(R)-alpha-lipoic acid reverses the age-related accumulation of iron and depletion of antioxidants in the rat cerebral cortex〔J〕.Redox Rep，2005;10(1):52-60.

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7 Mukherjea D，Jajoo S，Kaur T，et al.Transtympanic administration of short interfering(si)RNA for the NOX3 isoform of NADPH oxidase protects against cisplatin-induced hearing loss in the rat〔J〕.Antioxid Redox Signal，2010;13(5):589-98.