不同制备工艺消瘤平糖浆剂对小鼠免疫功能的影响

李灿，吴倩，曹军华

（襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021）

不同制备工艺消瘤平糖浆剂对小鼠免疫功能的影响

李灿，吴倩，曹军华

（襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021）

目的：研究不同工艺制备的消瘤平糖浆剂对小鼠免疫功能影响。方法：用不同体积分数乙醇将小柴胡汤进行分级沉淀，分别加入华蟾素和氟尿嘧啶制成消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ、消瘤平－Ⅲ、消瘤平－Ⅳ4种糖浆剂，采用MTT法检测其对脾淋巴细胞增殖情况，中性红法测腹腔巨噬细胞吞噬功能。结果：消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ、消瘤平－Ⅲ均能促进脾淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用，且具有一定的量效关系。结论：所制备的4种糖浆剂中消瘤平－Ⅰ提高小鼠免疫功能效果最好。

制备工艺；消瘤平；免疫；淋巴细胞；巨噬细胞

现代医学证实，肿瘤的发生、发展以及复发、转移与机体的免疫功能紊乱或失衡，特别是抗肿瘤能力低下有关［1］。中药治疗恶性肿瘤，通过扶正祛邪，可增强机体免疫功能，能减轻患者用化疗药后的临床症状，提高患者术后生存质量，有较明确的抗复发效果。本文将中成药和化学药制成复方制剂，以提高荷瘤小鼠的免疫功能为指标来筛选消瘤平的制备工艺。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器 R206旋转蒸发仪（上海申升科技有限公司）；TDL－5低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZF－6260型真空干燥箱（上海市精宏试验设备有限公司）；ELx800型酶联免疫检测仪（BIO－TEK公司）。

1.2 药物及试剂 柴胡，炙甘草，黄芩，大枣，法半夏，党参等由深圳市三九现代中药有限公司提供；华蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，批号100907－2）；氟尿嘧啶（天津金耀氨基酸有限公司，批号101125）；RPMI 1640培养基（Gbico公司）；刀豆蛋白A和MTT（Sigma公司）；超纯水为自制；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验动物 ICR小鼠150只，6周龄左右，（20±2）g，雌雄兼用，由湖北文理学院医学院动物实验中心提供，合格证号：襄医动字第2001001号。

2 方法

2.1 消瘤平糖浆剂的制备 工艺流程如下：

图1 消瘤平的工艺流程Fig 1 Technological process

采用旋转蒸发仪提取消瘤平，HPLC测得消瘤平Ⅰ－Ⅳ中黄芪苷含量分别为1.97，2.12，2.32，2.37 mg·mL－1。

2.2 动物分组、模型制备及给药 按文献［2］方法制备H22模型小鼠，接种24 h后，随机分为荷瘤对照组、阳性对照组及消瘤平Ⅰ～Ⅳ各3个剂量组，每组10只。正常对照组和荷瘤对照组灌胃生理盐水0.2 mL·d－1；阳 性 对 照 组 腹 腔 注 射 5－Fu 25 mg·kg－1·d－1；消瘤平 Ⅰ－Ⅳ 3 个剂量组分别按照12.5、25、50 mg·kg－1·d－1灌胃，皆连续给药10 d。

2.3 淋巴细胞增殖反应的测定 停药次日在超净工作台无菌取出小鼠脾脏，制备各组的脾细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞数为1×107/mL。ConA（或LPS）作为刺激源在体外培养48 h，MTT测定细胞增殖反应。用酶标仪于570 nm处测定各孔的OD值。

2.4 中性红法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能 末次给药24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌收集小鼠腹腔液，1 000 r·min－1离心，Hanks液洗涤细胞3次，1640培养液制备细胞悬液。取3 mL置培养皿中，37℃，5%CO2培养2 h，巨噬细胞黏附于容器表面，用4℃Hanks液吹吸，收集黏附细胞，血球计数板计数并调整细胞密度为2×109个/L－1，置37℃培养箱培养2 h后，弃上清和非贴壁细胞。取贴壁巨噬细胞，加0.1%中性红生理盐水，37℃继续培养30 min，弃中性红，用37℃PBS反复冲洗巨噬细胞，用体积分数50%醋酸和50%乙醇稀释后，测OD值。2.5 统计学分析 本实验所用数据采用office 2007、SPSS15.0整理、统计、分析。计量资料以±s表示，组间比较采用dunnett检验。

3 结果

3.1 不同制备工艺的消瘤平对荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响 模型组小鼠T、B淋巴细胞增殖明显受到抑制；5－Fu（25 mg·kg－1）腹腔注射给药使T、B淋巴细胞增殖水平更加低下；给药组除消瘤平－Ⅳ外，其余3种均能促进T、B淋巴细胞的增殖，且具有浓度依赖性，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），其中以消瘤平－Ⅰ免疫活性最强，结果见表1。

3.2 不同制备工艺的消瘤平对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 与正常对照组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能显著下降（P＜0.001）；5－Fu（25 mg·kg－1）腹腔注射给药使巨噬细胞吞噬功能更加低下；灌胃给予消瘤平－Ⅰ和Ⅱ后，小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能呈剂量依耐性升高，与模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001），消瘤平－Ⅲ中、高剂量也能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能（P＜0.05，P＜0.01），其中以消瘤平－Ⅰ免疫活性最强。见表2。

表1 不同制备工艺消瘤平对荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响（±s，n＝6）Tab 1 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on T，B lymphocyte proliferation in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

表1 不同制备工艺消瘤平对荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响（±s，n＝6）Tab 1 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on T，B lymphocyte proliferation in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.001；与CTX组比较，cP＜0.05，dP＜0.01

组别 剂量/mg·kg－1 T细胞OD值 B细胞OD值对照组 － 0.570±0.065 0.558±0.033 040模型组 － 0.363±0.031a0.348±0.030b 5－Fu 25 0.354±0.031 0.344±0.032消瘤平－Ⅰ 12.5 0.417±0.006c 0.412±0.009d消瘤平－Ⅰ 25 0.428±0.004d 0.420±0.013d消瘤平－Ⅰ 50 0.454±0.006d 0.434±0.015d消瘤平－Ⅱ 12.5 0.416±0.014c 0.403±0.030c消瘤平－Ⅱ 25 0.420±0.017c 0.415±0.020c消瘤平－Ⅱ 50 0.436±0.016d 0.419±0.004d消瘤平－Ⅲ 12.5 0.408±0.016c 0.406±0.014c消瘤平－Ⅲ 25 0.418±0.018c 0.403±0.017c消瘤平－Ⅲ 50 0.429±0.018c 0.414±0.014d消瘤平－Ⅳ 12.5 0.343±0.030 0.393±0.044消瘤平－Ⅳ 25 0.365±0.030 0.395±0.043消瘤平－Ⅳ 50 0.379±0.037 0.401±0.

表2 不同制备工艺消瘤平对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（±s，n＝6）Tab 2 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on macrophage phagocytosis in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

表2 不同制备工艺消瘤平对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（±s，n＝6）Tab 2 Influence of different preparation technologies of Xiaoliuping on macrophage phagocytosis in tumor－bearing mice（±s，n＝6）

注：与对照组比较，aP＜0.001；与 CTX 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01，dP＜0.001

组别 剂量/mg·kg－1 巨噬细胞OD值对照组 － 0.840±0.079 046模型组 － 0.505±0.011a 5－Fu 25 0.485±0.032消瘤平－Ⅰ 12.5 0.628±0.073b消瘤平－Ⅰ 25 0.650±0.095b消瘤平－Ⅰ 50 0.685±0.047d消瘤平－Ⅱ 12.5 0.609±0.030c消瘤平－Ⅱ 25 0.629±0.086b消瘤平－Ⅱ 50 0.630±0.089b消瘤平－Ⅲ 12.5 0.599±0.096消瘤平－Ⅲ 25 0.637±0.040c消瘤平－Ⅲ 50 0.626±0.088b消瘤平－Ⅳ 12.5 0.530±0.028消瘤平－Ⅳ 25 0.550±0.041消瘤平－Ⅳ 50 0.587±0.

4 讨论

消瘤平糖浆剂是小柴胡汤加上华蟾素和氟尿嘧啶组成。小柴胡汤是中医和解少阳的著名代表方剂，由柴胡、炙甘草、黄芪、大枣、法半夏、党参6味中药组成［3］。中成药和化学药所属不同体系，但其治病的目的是一样的。某些化学药治疗作用明显但不良反应大，与中药配伍后，在提高疗效的同时还能减轻不良反应。肿瘤患者接受化疗后常出现燥热伤津所致的阴虚内热或气阴两虚，治以滋阴润燥清热或益气养阴中药而取效。氟尿嘧啶是抗肿瘤化疗药，常产生呕吐、恶心等胃肠道不良反应；小柴胡和解少阳，疏肝利胆，通达表里；黄芪、党参为补中益气药，能调整胃肠功能；炙甘草补脾和胃，用于脾胃虚弱，并提高免疫功能；小柴胡汤联合华蟾素和氟尿嘧啶可提高抗肿瘤疗效，并减少化疗的不良反应。近年小柴胡汤调节免疫、抗肿瘤作用以及对神经－内分泌－免疫系统的调节作用越来越受到更多学者的重视［4－5］。

本文用不同体积分数的乙醇将消瘤平水提液进行分级沉淀、分离纯化，去除醇溶性物质，得到各级沉淀物。所得沉淀部分分别加水溶解后再加入华蟾素和化学药氟尿嘧啶制成糖浆剂，采用单核细胞直接细胞毒性测定法检测其对荷瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响，以及中性红法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能，以提高荷瘤小鼠免疫活性为指标优选消瘤平糖浆剂的制备工艺。在水提醇沉法中，醇沉浓度是比较关键的因素，影响消瘤平的得率及含量。对首乌藤多糖［6］的研究证明，乙醇在55%～85%之间，其得率与醇沉浓度几乎呈正相关，80%醇沉浓度时得率和含量均达到最高，与相关报道一致。

免疫系统作为一个完整的、自主的系统在维护和调整生命活动中起着重要作用，免疫功能失调可加速机体正常细胞的癌变。恶性肿瘤的发生和发展与机体免疫功能状况关系密切［7］。本实验结果显示，消瘤平－Ⅰ、消瘤平－Ⅱ和消瘤平－Ⅲ均能明显提高荷瘤小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能，其中以消瘤平－Ⅰ的效果最好。由此推断，消瘤平可以促进淋巴细胞增殖，提高机体非特异性细胞免疫和免疫调节功能，起到抗肿瘤作用，其中黄芪苷含量最低的消瘤平－Ⅰ免疫活性最强，由此可见，药理活性和含量并不成正相关，可能与其中所含成分有关，这还有待进一步研究。

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Influence of Xiaoliuping syrup produced by different preparation technologies on immune function in mice

LI Can，WU Qian，CAO Jun－hua
（Xiangyang Central Hospital，Hubei Xiangyang 441021，China）

OBJECTIVETo study the influence of Xiaoliuping syrup produced by different preparation technologies on immune function in mice.METHODSWater extracts of Xiao Chaihu decoction underweng fractional precipitation by ethanol of different concentrations.Cinobufagin and fluorouracil were added and produced Xiaoliuping－Ⅰ，Xiaoliuping－II，Xiaoliuping－III and Xiaoliuping－IV respectively.MTT assay was used to detect the proliferation of spleen lymphocytes.Phagocytosis of peritoneal macrophages was tested by neutral red test.RESULTSXiaoliuping－Ⅰ，Xiaoliuping－Ⅱand Xiaoliuping－Ⅲall were able to promote the proliferation of spleen lymphocytes and phagocytosis of peritoneal macrophages，the dose－effect relationship existed.CONCLUSIONXiaoliuping－Ⅰbest the improved immune function in mice best.

preparation technology；Xiaoliuping；immune；lymphocyte；macrophages

R969

A

1001－5213（2013）01－0032－03

李灿，男，主管药师，电话：13907278660，E－mail：lican1978＠126.com

曹军华，男，主管药师，E－mail：iamforever＠sina.com

2012－07－22