c－myc蛋白在不同毛色羊驼皮肤中的定位及表达

张丹丽，田雪，董常生

（山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801）

c－myc是在MC29鸟类转录病毒中被证实的具有转化作用的癌基因，为myc基因家族成员之一，定位于人类染色体8q24［1］，其编码的c－myc蛋白由439个氨基酸残基组成［2］。c－myc为螺旋环螺旋／亮氨酸拉链家族的DNA结合蛋白，通过与Max作用，调控细胞增殖、分化及凋亡等重要生理功能［3］。研究表明c－myc高表达于脉络膜恶性黑色素瘤细胞中并可作为其诊断依据［1］。国内外已有学者对一些物种的c－myc与毛发发育等方面进行过研究［4，5］。羊驼为毛用型经济动物，具有22种遗传稳定的自然毛色，是研究毛用动物毛色形成机制的理想型材料［6，7］。c－myc是否在羊驼皮肤组织中表达，它与羊驼毛色形成过程的关系如何，尚未有研究报道。因此，本试验拟研究c－myc在羊驼皮肤中的定位，并通过检测其在不同毛色羊驼皮肤中的蛋白表达情况，探索c－myc与毛色形成的关系，以期为c－myc参与毛色形成调控机制的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 材料

随机挑选3岁左右的棕色和白色雄性青年羊驼各3只，由山西农业大学羊驼养殖基地提供。剃毛后用取皮器取1cm2左右皮肤组织1块，置于Bouin’s固定液中固定，石蜡包埋后制成切片，用于免疫组织化学分析。

1．2 主要试剂和仪器

兔抗c－myc多克隆抗体，HRP－山羊抗兔IgG均购自北京博奥森生物技术公司；DAB显色试剂盒购自武汉博世德生物工程有限公司。

1．3 免疫组织化学方法

将固定于Bouin’s固定液中的组织取出，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、修块、切片，制成5μm厚的石蜡切片。石蜡切片经常规脱水，用3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，PBS清洗3次（每次5min）。滴加封闭液，室温放置20min。甩掉封闭液，滴加1∶80稀释的一抗，室温放置30 min后4℃过夜。取出后，室温放置30min，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育20min。PBS清洗，滴加DAB显色液显色5～10min。PBS清洗，苏木精轻度复染，脱水、透明后，中性树胶封片。PBS替代一抗作为阴性对照。

光镜下观察切片，每只羊驼取3张切片，每张切片用DP软件采集5个视野，对染色结果用Image－Pro Plus6．0软件进行图像分析，测定阳性反应物的平均光密度，进行吸光度分析。分析结果用平均值±标准误（Mean±SE）表示。

2 结果和分析

免疫组织化学试验结果见图1。由图1可见，免疫组织化学染色结果显示，在棕色和白色羊驼皮肤组织切片中，毛囊毛球部细胞中存在c－myc蛋白棕黄色阳性反应，着色深浅不等，对照组未观察到阳性细胞。对c－myc蛋白在不同毛色羊驼皮肤组织中的阳性细胞的平均光密度值进行测定比较（表1），结果显示，c－myc在棕色和白色羊驼皮肤组织中阳性细胞的表达量差异极显著（P＜0．01）。

图1 羊驼皮肤组织c－myc免疫组织化学染色（放大倍数：×40）Fig．1 Expressions of c－myc protein in skin tissue of alpacas showed by immunohistochemical method（Magnification：×40）

表1 阳性表达细胞的平均光密度Table 1 Average optical density of c－myc positive cells in alpaca skin

3 讨论

哺乳动物的毛色是由黑色素细胞产生的两种不同类型的色素（真黑素和褐黑素）的分布及比例决定的［6］，其过程受多条信号通路调控，Wnt信号通路为其重要一条，它通过调节毛囊隆突部的毛囊干细胞与上皮细胞间的分化影响色素生成［8］。Irina［9］指出c－myc的缺失将影响黑色素干细胞的发育，使发挥正常功能的黑色素细胞数量减少。已有研究表明c－myc作为Wnt信号通路中的一个下游信号分子，该通路中的重要分子β－catenin能够通过调控 Tcf－4从而激活c－myc的表达［10］。研究发现在羊驼皮肤毛囊毛球部存在c－myc阳性免疫反应物，且c－myc蛋白在棕色羊驼中表达量为白色羊驼的5．51倍，本实验室于秀菊等证实β－catenin在棕色羊驼皮肤中的表达量显著高于白色羊驼［11］。这与文献所述两者量的关系相一致。由于毛球部是产生并直接向毛干运输黑色素的唯一部位［12］，因此推测β－catenin通过激活c－myc 的表达来影响羊驼毛色形成，但c－myc在羊驼毛色形成调控过程中的具体作用还有待于进一步的研究。本研究为c－myc参与羊驼毛色形成提供了一定的理论基础。

［1］于洋洋．c－myc致癌蛋白在脉络恶性黑色素瘤中的表达与意义［J］．哈尔滨医科大学学报，2009，43（6）：609－614．

［2］宋建明．c－myc蛋白的分子作用机制研究进展［J］．国际病理科学与临床杂志，1996，16（3）：151－154．

［3］Nair S K，Burley S K．X－Ray Structures of Myc－Max and Mad－Max Recognizing DNA［J］．Cell，2003，112：192－205．

［4］王宁．c－myc在小鼠毛囊形成和毛发再生过程中的作用初探［D］．第三军医大学，2010．

［5］郭燕燕．c－myc在毛囊胚胎发育及生长周期中作用的初步研究［D］．第三军医大学，2008．

［6］张俊珍，董常生，范瑞文，等．哺乳动物毛色形成研究进展［J］．动物医学进展，2006，27（增）：65－68．

［7］董彦君，曹靖．羊驼被皮系统组织学研究进展［J］．畜牧兽医科技信息，2008，（2）：7．

［8］Rabbani P，Takeo M，Chou W，et al．Coordinated activation of wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration［J］．Cell，2011，145（6）：941－955．

［9］Irina Pshenichnaya，Karine Schouwey，Marzia Armaro，et al．Constitutive gray hair in mice induced by melanocyte－specific deletion of c－myc［J］．Pigment Cell Melanoma Res，2012，25（3）：312－325．

［10］Tong－Chuan He，Andrew BS，Carlo Rago，et al．Identification of c－myc as a Target of the APC Pathway［J］．Science，1998，281（5382）：1509－1512．

［11］于秀菊，董常生，范阔海，等．β－catenin在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位［J］．畜牧兽医学报，2010，41（3）：335－340．

［12］Slominsik A，Wortsman J，Plonka P M，et a1．Hair follicle pigment［J］．Journal of Investigative Dermatology，2005，124（1）：13－21．