鸡冠花离体培养优化的探讨

郭 丽，王存纲，王军玲

(1．河南农业职业学院，河南 郑州 451450;2．鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁 458030;3．深圳市第二职业技术学校，广东 深圳 518107)

鸡冠花 (Celosia cristataL．)属于苋科青葙属一年生草本植物［1］。鸡冠花原产东亚及南亚亚热带和热带地区，世界各地均有栽培。适于作一年生花卉露地栽培，矮生种也可盆栽［2］。鸡冠花绿化装饰效果强，还可做切花和干花的材料［3］，学者们多对鸡冠花的药用、食用价值进行研究［4－10］，被推测是一种很有开发利用前景的天然食药兼备的功能性色素资源［11］。其含有丰富的营养素及色素，食用安全，有广阔的开发利用价值和规模化生产的前景。

鸡冠花采用传统的播种繁殖，繁殖系数低。又因异花授粉，天然杂交容易造成品种特征混杂和品种退化，逐渐失去原有价值，留种植株需要注意隔离［12］。应用组织培养技术则可保持原品种的特性，减少制种的麻烦，还可极大提高繁殖系数，节约成本。本文旨在探讨鸡冠花快速繁殖所需条件，为组培快繁体系的构建、工厂化育苗和品种保持提供理论依据和参考价值，并为以后的遗传转化和倍性育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试鸡冠花种子由河南农业职业学院花卉实验室提供。

1.2 处理设计

灭菌试验。设75%乙醇+0.1%升汞5种不同时间组合进行种子灭菌处理 (表1)，接种后及时观察统计，比较各种灭菌方式的效果及苗的生长状况。

表1 灭菌处理组合对鸡冠花种子萌发的影响

激素配比试验。切取无菌苗顶芽接入外加不同激素浓度和配比的MS培养基中，进行最适激素配比的筛选，共计13种处理组合 (表2);取生长相对一致的不定芽接入外加不同激素浓度和配比的MS培养基 (表3)。每种处理接种30个，重复3次。培养25 d后，观察统计，筛选出最适培养基。

生根试验。将生长健壮，高2～3 cm的试管苗，转移到生根培养基上诱导不定根的产生。生根培养基采用1/2MS、MS为基本培养基，附加不同浓度生长素 (表4)。每处理20株，15 d后统计生根率，筛选出最佳生根培养基。培养室温度为 (25±2)℃，光照12～14 h，光照强度1 500～2 000 lx。

2 结果与分析

2.1 灭菌

外植体的灭菌效果直接影响着试验的进程。由表1可知，灭菌时间的长短影响着灭菌效果。当升汞处理时间为6～8 min时，灭菌不彻底，存在污染现象;当≥10 min时，污染率为0。随着乙醇和升汞处理时间的延长，污染率虽为0，对材料的伤害力却逐渐增大，致使发芽时间延长2～3 d，甚至1周不等，且萌发率有所降低。结果表明，在所进行的灭菌处理中，以酒精灭菌30 s外加HgCl2(加数滴吐温-20)灭菌10 min的处理组合最佳，即洗涤剂浸泡10 min，自来水冲洗30 min，75%乙醇漂洗30 s，0.1%的升汞灭菌10 min，无菌水冲洗4～6次，无菌率达100%，芽萌发率达100%，出芽所需时间短。而且从后期观察中发现无菌苗整齐度高，生长一致。种子从灭菌之后，经过1周左右，开始萌发，12 d左右逐渐长出真叶，当20 d后长出3～4片真叶时，即行下步试验。

表2 激素处理组合对鸡冠花初代培养的影响

2.2 初代培养

由表2可知，6-BA和NAA对鸡冠花的芽诱导起着重要的作用，无任何激素的情况下，不能诱导出芽，而当加入激素后随浓度的升高，芽的诱导率提高，平均腋芽数增多。6-BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1处理组合增殖系数最大，为1.27。

从生长表现上可知，当6-BA浓度＞1.0 mg·L－1时，所形成的芽开始变小，生长表现不良，不利于以后的生长。从生长状况来看，6-BA 2.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1处理增殖系数最大，诱芽最多;6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1处理则再生不定芽大，长势好。综合考虑则以6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.20 mg·L－1为最佳的初代培养基。

表3 激素处理组合对不定芽继代增殖培养的影响

表4 激素处理组合对鸡冠花生根诱导的影响

2.3 继代增殖培养

从表3看出，当单独使用6-BA时增殖效果差，出现短而扁的茎，整个芽呈并生状态，叶片不伸。随6-BA浓度越高，叶片卷曲度更高，随后转接发现它会向花芽转变 (图1)，说明6-BA可能利于花芽形成。适宜的激素组合可使。

图1 增殖培养中出现的并生芽

芽的增殖系数达到最高。通过观察及多重比较认为，以 6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 0.10 mg·L－1增殖系数最大，达到1.43，产生的不定芽长势也最好，确定为最佳的增殖培养基。

2.4 生根诱导

从表4可知，IBA对生根具有重要作用，虽在无IBA情况下也能生根，但生根很少;当IBA浓度超过一定值后，随IBA浓度的提高，有生根率降低的趋势。以1/2MS为基本培养基上的生根率明显高于以MS为基本培养基的生根率，产生的根数也多。综合总体生根状况，以1/2MS+IBA 0.4 mg·L－1效果最好，生根率达 95%，根多且粗壮。

2.5 炼苗与移栽

当生根培养基上鸡冠花组培苗长到1～2 cm时，先炼苗以利其适应外界环境条件，具体做法为:不揭封口膜让试管苗在室温下放置2～3 d，再揭去封口膜继续炼苗1～2 d，加少许自来水 (目的是软化培养基和防止培养基长菌)继续炼苗1～2 d即完成炼苗过程。然后小心取出苗子，洗去附着在根上的培养基，将冲洗干净的组培苗用800倍的多菌灵溶液浸泡30 min，最后转入含水量为70%左右的无菌营养土中栽培。因鸡冠花为草本，叶片薄，易失水萎蔫，要特别注意覆盖塑料薄膜保湿，5～7 d后可揭去薄膜，让其自然生长。20 d后统计移栽成活率可达90%以上，而且植株生长健壮。

3 小结和讨论

本试验通过对鸡冠花外植体进行离体培养，优化了其再生体系。研究目的旨在指导并应用于生产，节约成本和适应大规模生产。

在植物的离体快繁中，激素是重要的调控因子。适宜的激素种类及其配比起着重要的作用。本试验在研究鸡冠花初代和继代培养中，得出激素是鸡冠花分化芽所必须的，否则不产生再生芽，在组织培养中，初代培养阶段的适宜激素浓度要高于继代阶段。在生根试验中，IBA的作用不容忽视，虽无激素基本培养基中鸡冠花也能生根，但根量少、较细，而在添加 IBA 0.4 mg·L－1后，得到了根量多，生长好的生根苗。

采用的植物器官、部位不同，所需的激素浓度、出芽方式也不尽相同。鸡冠花组培中有采用4～5 d苗龄子叶、子叶节于附加6-BA 2～3 mg·L－1+NAA 0.2 mg·L－1的 MS培养基上产生愈伤组织分化出芽进行快繁的［13］。本试验则是采用鸡冠花幼苗茎尖进行初代培养，以组培苗不定芽继代培养，并得到不同最佳浓度组合。另外，本试验中出现了并生状态芽的情况，这可能与激素有关，因为在同样条件下，未添加激素时，无这种情况发生，而当加入激素后才有此种现象出现，且随激素浓度提高其出现频率变大。

［1］中国植物志 (第二十五卷，第二分册)［M］．北京:科学出版社，1979．

［2］张树宝．花卉生产技术 ［M］．重庆:重庆大学出版社，2008．

［3］包满珠．花卉学 ［M］．北京:中国农业出版社，2003．

［4］陈静，姜秀梅，李坦，等．鸡冠花止血作用机制研究［J］．北华大学学报，2001，2(1):39－40．

［5］陈静，吴凤兰，张明珠，等．鸡冠花对小鼠免疫功能的影响 ［J］．中国公共卫生，2003，19(10):1125．

［6］李万里，王萍，王守英，等．钙与鸡冠花提取物对氟中毒大鼠骨代谢的影响 ［J］．新乡医学院学报，1999，16(4):289－291．

［7］李万里，田玉慧，沈关心．鸡冠花黄酮类对成骨细胞矿化和IGF-1的作用 ［J］．中国公共卫生，2003，19(11):1392－1393．

［8］Ashraf G，KapoorH C．Modifications in thepurification protocol ofcelosia critataantiviral proteins lead to protein that can be N-terminally sequenced ［J］．Protein and Peptide，2004，11(6):555－561．

［9］Baranwal V，K，Verma H N．Characterics of a virus inhibitor from the leaf extract ofCelosia cristata［J］．Plant Pathology，1997，46:523－529．

［10］彭子模，高雁，彭宇．新疆鸡冠花食用色素粗成分与有害微量元素含量的测定 ［J］．新疆师范大学学报:自然科学版，2003，22(4):31－32．

［11］李进，彭宇，彭子模，等．鸡冠花食用色素安全性的研究［J］．生物技术，2004，14(3):43－45．

［12］王秀峰，李宪利．园艺学各论 (北方本)［M］．北京:中国农业出版社，2003:458－459．

［13］韩会新，孙燕香．不同激素组合对鸡冠花离体快速繁殖的调控 ［J］．河北林业科技，2006(4):13－14．