黑芝麻黑色素萃取条件的响应面优化

杨善岩，李海龙，王升贵，狄志鸿，张 红，黄 哲，张 杰

(1.浙江亚林生物科技股份有限公司，浙江 富阳 311400;2.嘉吉亚太食品系统有限公司 上海分公司，上海 徐汇 200031;3.诺维信中国投资有限公司，上海 浦东 200129;4.天津生物工程职业技术学院，天津 300462)

天然黑色素 (melanin)是广泛存在于动植物体中的保护性色素，对生物机体有重要的保护作用。Nicollaus［1］根据黑色素降解产物不同将其分为吲哚型黑色素 (动物黑色素)和儿茶酚型黑色素(植物黑色素)。儿茶酚与单宁酸、鞣花酸等一起被称为植物体内的紫外线过滤器，具有很好的美容防晒效果［2］。黑色素属于生物大分子多聚物，分子量1 800～2 000 u，其结构单位为酚醌结构，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常见的有机溶剂，仅溶于少数几种有毒的有机溶剂，如甲醇、二甲基亚砜等，但能溶于碱性水溶液。黑色素在紫外波长下有吸收峰，其吸收值与波长成反比［3］。黑芝麻黑色素安全无毒，具有较高的营养价值和药理作用，广泛应用于食品工业，如饮料、糕点、糖果、巧克力、果酱等［4］，有着十分广阔的市场前景。

作者对文献报道的各种黑芝麻黑色素萃取工艺［5－7］进行了分析论证，结合黑色素的理化性质进行反复试验，发现采用碱提酸沉淀法简单可靠，可得到较纯的黑色素，并对萃取条件进行了响应面优化。

1 材料与方法

1.1 材料

市售黑芝麻，定量滤纸，NaOH、HCl均为分析纯。

1.2 萃取工艺

利用NaOH溶液在一定温度下水浴萃取，过滤后用HCl溶液中和滤液pH值至6.0，使黑色素絮凝。3 000 r·min－1离心10 min弃上清液，用水洗涤2～3次，于60℃烘干至恒重，即为黑色素粗品，得率计算公式如下:

式中:为得率 (%);m为黑色素质量 (g);W为黑芝麻质量 (g)。

1.3 色阶的计算

精确称取0.1 g自制黑色素，用pH值为8的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液溶解，定容至100 mL作为试样。吸取10 mL移入100 mL容量瓶，用缓冲液定容至100 mL为待测样，测其A270，色阶计算公式如下［8］:

E=A×n/W。

式中:E为色阶;A为吸光值;n为待测样品稀释倍数;W为样品质量 (g)。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂浓度对萃取效果的影响

分别称取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入30，35，40，45，50，55，60 g·L－1的 NaOH溶液50 mL，60℃水浴浸提60 min，制备黑色素。如图1所示，前期黑色素得率及色阶都与萃取剂浓度成正比，均在50 g·L－1时达到峰值，此后又下降。究其原因，NaOH浓度增加黑色素溶解度增大，然而随浓度的增加一些杂质的溶解率也在增加，与黑色素呈现竞争浸出，影响黑色素得率及纯度。

图1 萃取剂浓度对萃取效果的影响

黑色素存在于黑芝麻种皮中，种皮主要成分为黑色素和木质素，木质素易溶于NaOH溶液，更加速黑色素的溶解。NaOH溶液浓度不仅影响黑色素萃取效果，而且对成本及纯化也有较大影响，所以萃取剂浓度至关重要。

2.2 萃取混合物浓度对萃取效果的影响

分别称取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶，加入NaOH溶液，使萃取混合物浓度分别为200，220，240，260，280，300 g·L－1，60℃ 水浴浸提 60 min，制备黑色素。如图2所示，黑色素得率与萃取混合物浓度成反比，低于240 g·L－1得率及色阶较高且稳定;高于240 g·L－1黑色素得率及色阶急剧下降。

图2 萃取混合物浓度对萃取效果的影响

固液洗脱中，溶液比例越大越利于洗脱。因为溶液量越大，固相与液相之间的目标物质浓度差就越大，目标物质就越易溶解到液相。在黑芝麻萃取中，萃取液比例越大黑色素就越易溶出。

2.3 温度对萃取效果的影响

分别称取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加40 mL 50 g·L－1的NaOH溶液。分别于50，55，60，65，70，75，80，85，90℃水浴浸提 60 min，制备黑色素。如图3所示，黑色素得率与温度成正比，65℃后增加趋势变缓;色阶则呈现先高后低的趋势，65℃出现峰值。

图3 萃取温度对萃取效果的影响

水分子是不断运动的，温度越高水分子运动速率越快，溶质在溶液中的扩散速度就越快，所以黑色素溶解速率越快，但此时杂质也更易溶出而且黑色素的分解也在加速，使黑色素纯度降低。

2.4 时间对萃取效果的影响

分别称取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入50 g·L－1的NaOH溶液40 mL，分别于60℃水浴浸提 20，40，60，80，100，120，140 min，制备黑色素。如图4所示，黑色素得率随时间增长而提高，80 min后基本不再增加。色阶开始时与时间成正比，80～120 min最大，此后略有下降。

图4 时间对萃取效果的影响

黑色素溶出是一个渐进过程，时间越长得率越高，但时间越长杂质溶出也越多，影响纯度，所以萃取时间不宜过长。

2.5 萃取条件的响应面优化

用 Design-Expert8.0.6的 Box-Behnken试验，对黑色素萃取条件进行四因素三水平试验。因素、编码、－1，0，1水平:萃取剂浓度 (X1)分别为45，50，55 g·L－1;萃取混合物浓度 (X2)分别为260，240，220 g·L－1;萃取温度 (X3)分别为60，65，70℃;萃取时间 (X4)分别为 60，80，100 min。

试验结果见表1。

表1 Box-Behnken试验各处理组合的得率和色阶

利用Design-Expert8.0.6软件对结果进行分析，拟合得到黑色素得率及色阶的多元回归模型:

对回归模型进行方差分析，萃取剂浓度、萃取混合物浓度、温度和时间对得率及色阶有显著正效应，失拟项P值分别为0.139 6和0.055 0，均 ＞0.05，P为不显著，说明回归模型显著。决定系数R2分别为0.907 4和0.999 3，均 ＞0.9，说明回归模型拟合良好。

D为进一步研究相关变量之间的交互作用及确定最优点［9－10］，利用 Design-Expert软件分析二次回归模型，绘制响应面分析立体图和等高线图。图5－6为部分响应面分析立体图和等高线图，等高线图可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，各图中等高线均呈椭圆形，表明两因素交互作用显著，由立体图可见拟合面具有真实的最大值。经软件分析得到最佳萃取剂浓度、萃取混合物浓度、萃取温度及萃取时间分别为 50 g·L－1，240 g·L－1，65℃和80 min。得率和色阶的最高预测值分别为0.457 7%和245.223。

图5 萃取混合物浓度和温度对得率影响的响应面及等高线

2.6 验证试验

为验证模型预测的准确性，用优化后的条件进行试验，黑色素得率为0.439%，E=243.197，基本吻合模型预测最大响应值，说明模型合理有效。

图6 萃取剂浓度和萃取混合物浓度对色阶影响的响应面及等高线

3 小结与讨论

黑芝麻黑色素是一种营养及食用价值均很高的天然功能性色素，我国对黑芝麻黑色素的研究开发较少。本研究采用响应面法，对黑芝麻黑色素的碱提酸沉淀萃取工艺进行优化，得到最佳萃取剂浓度、萃取混合物浓度、萃取温度及萃取时间分别为50 g·L－1，240 g·L－1，65 ℃ 和 80 min。经验证得率和色阶分别为0.439%和243.197。

该工艺制备的黑色素粗品，得率较高，E＞240，纯度略低于样品 (E=310)，所以后期还需要一定的纯化工作。需要注意的是，在黑色素分子中存在氨基，中和滤液碱性时HCl溶液浓度不能太高，否则会因 HCl局部浓度过高，与氨基反应放出NH3。另外，萃取次数对黑色素得率也有一定的影响，在实际生产中可多次萃取，以提高黑色素得率。该工艺简单、成本低廉，而且可变废为宝提高黑芝麻的附加值。

［1］Nicolans R A． Melanins［G］//Chemistry of Natural Products．Pairs:Harmann，1968:68 －91．

［2］周文杰，鲍时安．苹果多酚防晒霜的研制 ［J］．广东化工，2008，35(2):46－48．

［3］单良，徐丽萍，金青哲，等．黑芝麻黑色素的稳定性及自由基清除活性 ［J］．安徽农业科学，2008，36(26):11527－11531．

［4］张奇志，赖来展，廖均元．黑色食品的营养与功能研究进展 ［J］．粮油食品科技，2006，14(6):11－13．

［5］徐丽萍，王兴国，金青哲，等．黑芝麻中黑色素萃取条件的研究 ［J］．中国油脂，2006，31(4):56－59．

［6］孙玲，张名位．黑芝麻色素的萃取条件和稳定性研究［J］．中国粮油学报，1998(4):53－58．

［7］武文洁，姚培正，王万森，等．黑芝麻色素萃取与性质研究 ［J］．广州食品工业科技，2002，18(1):32－33．

［8］李昌，聂少平，谢建华．黑芝麻黑色素的研究进展 ［J］．食品工业科技，2010，31(6):41－416．

［9］Li Chuan，Bai J H，Cai Z L．Optimization of a cultural medium for bacteriocin production byLactococcus lactisusing response surface methodology ［J］．Journal of Biotechnology，2002，93:27－34．

［10］华承伟，于江傲，谢凤珍．红色链霉菌发酵产红霉素培养基的响应面优化 ［J］．生物制品学杂志，2011，24(6):728－736．