HPV16/18和端粒酶在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达及临床意义

丁聪聪 姜晓萍 (广东医学院中美联合肿瘤研究所，广东 东莞 523808)

宫颈上皮内瘤变(CIN)是一组与宫颈浸润密切相关的癌前期病变，反映了宫颈癌(CC)发生中连续发展的过程，CIN的早期筛查、诊断能有效降低CC的发病率。因此，临床上迫切需要一种可靠的指标以早期发现CIN，阻止其向浸润性癌方向发展〔1〕。本研究采用聚合酶链反应(PCR)技术和重复片段扩增方法银染定性法(TRAP-PCR)，对所有样本宫颈组织中人端粒酶基因(hTERC)和人乳头瘤病毒(HPV16/18)的感染和表达情况进行检测，以期了解HPV16/18和hTERC的表达与CIN和CC的关系，旨在为CIN和CC早期诊断提供新的指标。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2010年1月至2012年1月我院收治的CIN和CC患者各30例。30例CIN病例年龄45～57〔平均(49.6±6.4)〕岁，其中CINⅠ10例，CINⅡ9例，CINⅢ 11例;30例CC病例均为浸润性CC(ICC)，年龄55～65〔平均(57.8±5.8)〕岁。所有CIN和CC病例均符合国家卫生部发布的《子宫颈癌诊断》关于CIN和ICC的诊断标准〔2〕，并经细胞学检查和阴道镜检查确诊。随机选择同时期在本院门诊就诊的宫颈正常30例病理标本作为对照，年龄55～67〔平均(60.1±5.9)〕岁。所有病例均未接受过放疗或化疗、宫颈和子宫切除手术和服用过激素类药物治疗。各组病例在年龄等各方面具有均衡性(P＞0.05)。同时，研究前均告知患者或其家属，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织标本采集 用薄层液基细胞学宫颈刷插入宫颈口，取病例宫颈的新鲜组织，立即用无菌双蒸水洗涤，将洗涤后的组织用手术刀片尽可能切碎，置入1.5 ml无菌离心管内。

1.2.2 HPV16/18 PCR扩增和电泳检测 分别采用QIA Mini试剂盒(QIAGEN，美国)和病毒核酸试剂盒(Roche，德国)提取宫颈组织中HPV16/18 DNA模板。采用PCR扩增反应和聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对患者血中HPV DNA进行检测。以HPV16/18 DNA模板，利用PCR扩增反应对所有90个病例的血液DNA提取物进行扩增，扩增程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 45 s，重复 30循环;72℃延伸5 min 1个循环;4.0℃保存。在10%非变性PAGE上电泳检测扩增产物，银染观察结果。扩增的引物序列HPV16为前向:5'TTATTTTGAGCTTTGGTTCTG3';反向:5'CCCGCTTTC GTAGTTTCAT3';HPV18为前向:5'TGCAGCACGAATAAGGCACTGGCCTC3';反向:5'CACGGCGACCCTACAAGCTACGG3'，由上海生工合成。HPV 16的阳性扩增片段大小为184 bp，而HPV 18的阳性扩增片段为154 bp。

1.2.3 hTERC PCR扩增和电泳检测 hTERC扩增模板参照虞伟等〔3〕公布的方法。采用TRAP和PAGE电泳对患者组织中hTERC DNA进行检测。扩增程序同上，引物序列为TS:5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';CX:5'-CCCTTACCCTTACCCTTAC CCTAA-3'。凡在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，表示样本为hTERC阳性，阴性表达者仅出现一条35 bp内对照条带，条带的深浅表示hTERC活性的大小。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，计数数据采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关分析，关联分析采用Logistic回归分析。

2 结果

2.1 HPV16/18 PAGE电泳检测结果 分别从ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宫颈病例中随机选取4例进行HPV16/18的PCR扩增和电泳检测，结果发现ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ组和正常宫颈病例HPV16阳性条带检测数分别为4、4、3、2和0条。而ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宫颈病例HPV18阳性条带检出数分别为4、3、2、2 和0 条。见图1，图2。

图1 HPV 16 DNA检测图谱

图2 HPV 18 DNA检测图谱

2.2 hTERC聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果 从ICC、CINⅠ～Ⅲ和正常宫颈病例中随机选取2例进行hTERC的扩增和电泳检测，ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ和正常宫颈病例出现相隔6 bp的梯状条带的例数分别为2、2、2、2和0条。同时显示hTERC扩增条带亮度从ICC、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ依次减弱。见图3。

图3 hTERC聚丙烯酰胺凝胶电泳检测TRAP银染结果

2.3 各组患者 HPV16/18阳性率比较 ICC HPV16/18阳性感染率极显著高于CIN组和正常宫颈组(P＜0.01)，而CIN组HPV16/18阳性感染率显著高于正常宫颈组(P＜0.05)。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ组间比较，CINⅢ HPV16/18阳性感染率极显著高于CINⅡ和CINⅠ组(P＜0.05)，CINⅡ HPV16/18阳性感染率极显著高于CINⅠ组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组患者HPV16/18阳性率统计结果〔n(%)〕

2.4 各组患者hTERC阳性率比较 ICC、CIN以及正常宫颈癌组hTERC阳性率分别为93.33%28例、53.33%(16例)和3.33%(1例)。ICC hTERC阳性感染率〔8例(72.72%)〕极显著高于CIN组和正常宫颈组(P＜0.01)，而CIN组hTERC阳性感染率显著高于正常宫颈组(P＜0.05)〔8例(72.72%)〕。CINⅢ、CINⅡ和CINⅠ组间比较，CINⅢ 组hTERC阳性感染率极显著高于 CINⅡ〔5例(55.56%)〕和 CINⅠ组〔3例(30.0%)〕(P＜0.05)，CINⅡ组hTERC阳性感染率极显著高于CINⅠ组(P＜0.05)。

2.5 HPV16/18和hTERC阳性率与CIN和ICC易感性关联分析 CIN和ICC易感性与HPV16/18和hTERC阳性率存在显著关联性，其中ICC和CINⅢ与HPV16/18和hTERC阳性存在显著正相关(P＜0.05)。而正常宫颈组织与 HPV16/18和hTERC阳性率不存在关联性(P＞0.05)。见表2。

表2 HPV16/18和hTERC阳性与CIN和ICC易感性

3 讨论

20世纪70年代末，Hausen首次提出CC的HPV病因假说，认为CC与HPV16和18等高危型HPV的持续感染相关。HPV是一种双链DNA病毒，具有球形外壳，可以寄生于受损的宫颈上皮，使宫颈处于持续感染状态，导致宫颈上皮发生不典型增生，引起不同程度上皮瘤变，继而发生CC〔4〕。近年来，国内外众多研究证实高危型HPV 16、18等亚型与CC发生发展密切相关。梅佳等〔5〕研究认为HPV感染与CIN变呈正相关，是CIN早期筛查的理想手段。周斌等〔6〕研究发现高危型 HPV 16/18感染与CC及CC癌前病变的发生、发展密切相关，HPV 16/1 8 DNA检测敏感性高于液基细胞学，对宫颈炎等良性病变的阴性预测值高于液基细胞学。Cogliano等〔7〕研究认为宫颈HPV感染的检测结合其他辅助检查，对预防CC的发生有一定的意义，并具有进一步的推广和应用价值。Carozzi等〔8〕发现HPV16/18可更早发现CC和癌前病变，并对宫颈病变干预和治疗具有重要的指导意义。

本研究数据表明高危型HPV16/18与CIN和ICC的发病率存在密切关联性，可以通过检测患者宫颈组织中HPV16/18来早期诊断患 CC，这与梅佳等〔5〕和 Carozzi等〔8〕的研究结果一致。虽然高危型HPV16/18检测敏感性高，但特异性一般只有64% ～95%，尤其是年轻性生活活跃的妇女，许多HPV感染是暂时的，并不会导致CC的发生。细胞学筛查也仅是通过细胞学特征进行诊断，缺少组织结构特征，敏感性低，因而在诊断中也不可避免地出现一定的漏诊或误诊。高危型HPV16/18检测均不能同时达到较高的敏感性和特异性。因此，需要寻找其他更准确、更可靠、更有预见性的方法，以弥补上述监测指标的不足〔9〕。

现代细胞遗传学和分子生物学研究表明，CC的发生与人类3号染色体长臂的增加密切相关，其中涉及的最重要基因是人染色体hTERC，它可以阻止细胞凋亡，导致肿瘤的产生。因此，hTERC基因的异常扩增是 CC发生的早期事件，检测hTERC的扩增有助于 CC的筛查及早期诊断〔10〕。近年来，hTERC与CC关系的研究也成为热点，它已成为目前已知最为广谱的恶性肿瘤的分子标志物。赵继红等〔11〕采用TRAP-PCR，发现正常宫颈组织与CC癌变组织hTERC活性存在显著差异，认为hTERC在CC发生中可能起到重要作用，检测子宫颈病变中hTERC，对探讨宫颈病变的进展和CC的发生具有重要意义。贺昕红〔12〕采用荧光原位杂交方法，检测60例子宫颈脱落细胞hTERC的表达情况，发现hTERC基因的阳性表达与CC病变程度密切相关，提示在其发生发展中可能起重要作用，hTERC基因检测有望成为CC早期筛查方法之一。Alamed等〔13〕研究认为检测hTERC基因扩增有望成为协助预测宫颈病变进展的重要标记物，并可能减少病理组织形态学筛查的假阴性或漏诊情况。Heselmeyer等〔14〕采用TRAP检测CC患者，发现hTERC在CC组织中高度表达。以上大量研究结果均显示，活化与CC的发生发展关系密切。本研究也表明CC和hTERC活性存在极其显著的相关关系，可以通过检测患者宫颈组织中hTERC活性来判定是否患CC。

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