木醋杆菌分批补料发酵法生产广式米醋

傅 亮 易九龙 陈思谦 吴炳鸿

（1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.广州市如丰果子调味食品有限公司，广东 广州 511330）

传统的广式米醋通常以米酒及食用酒精为原料，以木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）作为主要产酸菌，采用表面静止发酵法生产［1］。发酵周期一般为40d以上，发酵总酸在3.5～4.5g／100mL，业内普遍认为广式米醋的发展应缩短发酵时间，提高发酵酸度。生产实践中发现，采用分批补料发酵法生产的广式米醋总酸，高于单批发酵总酸度。武斌等［2］研究也表明，以巴氏醋杆菌为菌种采用分批发酵法能明显提高醋酸度和乙醇转化率，缩短生产周期，节约成本。

本试验采用广州如丰果子调味食品有限公司在发酵车间分离的木醋杆菌菌株RF4作为发酵菌种，研究发酵总酸的变化规律，比较发酵过程中纤维素膜内与发酵液中菌体数的差异，探讨最适原料酒精度，并研究通过在发酵过程中采用分批补料法提高总酸的可行性并进行工艺参数的优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

菌种：自广州如丰果子调味食品有限公司米醋生产车间分离出的主要产酸菌RF4，经16SrDNA鉴定为葡糖醋杆菌属的木醋杆菌 （Gluconacetobacter xylinus）［3］；

纤维素酶：酶活18 391U／g，美国Sigma公司；

乙醇、碳酸钙、氢氧化钠等：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：HR－120型，上海精密科学仪器有限公司；

高压蒸汽灭菌器：YQX－SG46－280S型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

超净工作台：SW－CJ－1BU型，苏州安泰空气技术有限公司；

生化培养箱：PYX－190－A型，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种及培养基的制备

（1）液体菌种的制备［4］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷却至室温后接种RF4斜面菌种30℃下培养7d，菌落数测定为1.83×107CFU／mL。

（2）发酵液的制备［5］：10mg／mL葡萄糖、10mg／mL酵母粉，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右加入5%乙醇（V／V），冷却至室温后接种5% （V／V）菌种培养液，装液量为150mL，30℃下于生化培养箱中培养。

（3）平 板 计 数 培 养 基 的 制 备［6］：10mg／mL 葡 萄 糖、10mg／mL酵 母 粉、20mg／mL 碳 酸 钙、15mg／mL 琼 脂，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右加入3%无水乙醇，制成碳酸钙平板备用。

1.2.2 发酵总酸的测定 参照GB／T 5009.41——2003。

1.2.3 发酵液及细菌纤维素膜内木醋杆菌菌体数的测定

（1）细菌纤维素膜酶解液制备［7］：准确称量发酵液中生成的完整湿状细菌纤维素膜0.5g，加入0.1% （V／V）已活化好的纤维素酶溶液，用醋酸－醋酸钠缓冲溶液调pH至5.0，蒸馏水定容至10mL，35℃水浴至膜完全崩解，得纤维素膜酶解液。

（2）平板菌落计数法［8］：以梯度稀释法分别接种木醋杆菌发酵液和细菌纤维素膜酶解液，30℃恒温培养96h。选取菌落周围出现透明圈的菌落计数，根据梯度稀释倍数计算实际菌体数。从发酵第4天开始，每3d测定1次菌落数至第16天，单位CFU／g。

1.2.4 发酵过程中补加乙醇可行性试验与总酸测定 在发酵至第10天时补加2%（乙醇体积／发酵液体积）乙醇1次，每2d测定1次总酸，测定至第20天。

1.2.5 分批补料发酵最优条件的确定 对分批补料发酵液态发酵培养基，取每次乙醇添加量、间隔时间、开始补加时间及补加次数为因素进行四因素三水平的正交试验，因素水平表见表1。以发酵液中总酸为指标进行因素水平的评价。以上每组试验均做3次平行，要求误差小于5%，取算术平均值。

2 结果与分析

2.1 发酵液和细菌纤维素膜内木醋杆菌菌落数分布比较

木醋杆菌发酵产酸过程中，细菌纤维素膜及发酵液内都存在菌体。由比较结果（表2）可知，纤维素膜内及发酵液中的木醋杆菌菌体数自发酵第4天开始显著上升，第10天左右分别达到峰值，然后基本维持稳定，为菌体生长稳定期。随着底物的耗尽和产物的积累，二者的菌体数在第13天时均开始下降，至第16天分别为0.98×1010CFU／g和4.00×107CFU／g，在整个发酵过程中，细菌纤维素膜内的细胞数均远高于发酵液内的细胞数，前者在第10天时约为后者的300倍。结果表明，传统的广式米醋生产采用表面发酵法有利于菌体大量集中在气液交界的膜中，有助于耗氧代谢及传质，有利于发酵产酸，随后的分批补料发酵也应维持细菌纤维素膜的完整性。

表1 因子水平表Table 1 Factor level table

表2 发酵液及细菌纤维素膜内木醋杆菌菌体数Table 2 Cell number of Gluconacetobacter xylinus in fermented liquid and bacterial cellulose membrane

2.2 初始酒精度对木醋杆菌发酵产酸的影响

木醋杆菌在发酵过程中，酒精浓度的高低会影响菌体的生长和代谢［8，9］。初始酒精度对产酸影响见图1。在酒精含量为5% （V／V）时总酸可达4.2g／100mL左右，为其最适原料酒精度。

2.3 分批补料发酵提高总酸度的初步可行性

由图2可知，不补加乙醇组在第12天左右酸度达到最大值，初步确定在第10天补加乙醇，补加乙醇组在第16天酸度达到最大值（5.35g／100mL），且远高于不补加乙醇组。由此可见，发酵过程中补加乙醇可以提高最终总酸，通过分批补料法发酵提高广式米醋总酸是可行的。

图1 不同酒精含量对产酸的影响Figure 1 Total acidity under different alcohol content

图2 单批发酵法与补料法所产总酸度比较Figure 2 Total acidity of single batch fermentation and fed－batch fermentation

2.4 补料发酵最优条件的确定及验证实验

正交优化试验结果见表3。由表3可知，补料发酵过程中影响发酵产酸量的因素主次顺序为A＞B＞C＞D，即乙醇添加量＞间隔时间＞开始补加时间＞补加次数，最优组合为A3B1C1D2，即每次乙醇添加3mL，占发酵液体积2%，间隔时间为2d，在发酵第6天开始补加，补加次数为3次。按照最优组合A3B1C1D2进行验证实验，重复5次并以单批发酵作对比，最优组合产酸量均稳定在7.29g／100mL，而单批发酵仅为4.20g／100mL。

3 结论

（1）分批补料发酵法提高广式米醋总酸的最佳工艺为在发酵第6天开始，每隔2d添加发酵液体积2%的酒精，补加3次，最终酸度可达7.29g／100mL，较单批发酵提高了73.6%。

表3 补料发酵正交试验结果与分析Table 3 Orthogonal experiment design and analysis of fed－batch fermentation

（2）由于木醋杆菌在发酵过程中的最适酒精度为5%（V／V），较低的酒精量导致醋酸产量低，过高的酒精含量则会抑制木醋杆菌的生长代谢，单批发酵受制于此难以生产出高酸度米醋。本试验通过补加酒精法发酵既满足了木醋杆菌产酸的需要，又不致于酒精度过高而抑制其生长代谢，研究结果对于生产广式高酸米醋具有积极意义。

（3）本试验仅以酸度为指标对分批补料发酵法的工艺进行了优化，对于如何在提高酸度的同时改善米醋其它风味品质还有待于更深入的研究。

（4）特别值得注意的是，传统的广式米醋发酵所用的木醋杆菌，在发酵产酸的同时会合成细菌纤维素膜漂浮于发酵液表面，与中国其它醋种发酵有显著不同的特征。以酒精为代表的碳源，在转化为醋酸的同时，也合成了细菌纤维素。本试验研究表明细菌纤维素膜的存在，有助于富集大量菌体于膜内，且漂浮于发酵液表面有助于利用空气中的氧，并进一步有助于氧化酒精转化成乙酸。故分批补料过程中，不得破坏细菌纤维素膜。生产实践中也发现，纤维素膜完整性的破坏，会极大降低最终制品的总酸。因此，如何在发酵过程中保持纤维素膜的完整性，如何将乙醇尽量多的转化为乙酸，都为下一步设计高效连续生产的生化反应器、调整生产工艺提出了新的课题。

1 傅亮，陈思谦，易九龙，等.细菌纤维素膜对木醋杆菌发酵生产广式米醋的影响［J］.食品与发酵工业，2012，38（2）：123～125.

2 武斌，李丽，赵良启.醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵［J］.食品与药品，2007，9（1）：11～14.

3 傅亮，易九龙，陈思谦，等.传统广式米醋中醋酸菌的分离与鉴定［J］.中国调味品，2012，37（6）：57～60.

4 臧晋，刘凤霞，李永祥，等.高产醋酸菌的分离选育［J］.中国酿造，1999（5）：20～22.

5 陈义伦.优质苹果醋酿造技术及主要风味物质研究［D］.济南：山东农业大学，2002.

6 魏长庆，王海庆，张凌，等.葡萄果醋发酵用醋酸菌的分离及鉴定［J］.中国酿造，2010（4）：42～45.

7 贾士儒，欧竑宇，马霞，等.细菌纤维素结构与性质的初步研究［J］.纤维素科学与技术，2002，10（3）：25～29.

8 侯小歌，杜红阳，李学思，等.宋河大曲中醋酸菌的分离鉴定及产酸特性［J］.中国酿造，2011（4）：112～115.

9 Kiyoshi T，Tomoko A，Masahiro F，et al.Cellulose production by acetic acid－resistant Acetobacter xulinum ［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（3）：228～231.