不同Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌抗菌活性的研究

2013-09-07 10:37彭登峰柴春祥
食品与机械 2013年3期
关键词:酸乳抗菌肽干酪

彭登峰 柴春祥 马 玲 王 伟

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134;2.山西农业大学食品科学与工程学院,山西 太谷 030801)

干酪中添加益生菌可以对人体起到非常好的作用,嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物,它能调节人体肠道微生物菌群平衡,增强机体免疫力以及抑制肿瘤细胞形成[1];双歧杆菌可以抑制病原菌的生长,与发酵乳和酸奶相比,干酪具有较高的pH值,因此干酪更加支持酸敏感性双歧杆菌的长期存活[2];植物乳杆菌具有维持肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等多种功能[3]。

酪蛋白抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽,具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性[4]。干酪中丰富的酪蛋白是抗菌肽的重要来源。近年来干酪中酪蛋白抗菌肽的抑菌性引起了人们的广泛关注和研究。目前已于酪蛋白酶解物中发现了多种具有抑菌性的抗菌肽[5]。

现阶段中国对干酪抗菌肽的研究较少。本试验以不同成熟期的添加嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌的3种Mozzarella干酪为原料,用3种方法制备干酪的提取液,验证提取液对枯草芽孢杆菌的抗菌性。本试验的意义在于验证干酪中提取液的生理功能以及对微生物的抑制作用,为干酪抗菌肽的进一步开发利用提供参考依据与理论前提。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

1.1.1 原料乳

新鲜牛乳:密度1.030g/mL,干物质11.05%,蛋白含量3.03%,酪蛋白含量2.27%,将脂肪标准化至3.0%,使 C/F(酪蛋白∶脂肪)的比值为0.76,山西农业大学牧站。

1.1.2 供试菌种

Streptococcus salivarius subsp.thermophilus (唾 液 链球 菌 嗜 热 亚 种 )CH9、Lactobacillus delbrueckil subsp.bulgaricus(德氏乳杆菌保加利亚亚种)LB、Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)、Bifidobacteriasp.(双歧杆菌)、Lactobacillus plantarum (植 物 乳 杆 菌)、Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌):山西农业大学畜产品实验室。

1.1.3 主要试剂与仪器设备

氢氧化钠:分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;

冰醋酸、醋酸钠、三氯乙酸:均为分析纯,天津市嘉兴化工玻璃仪器工贸有限公司;

滤片纸:化学分析滤纸,杭州特种纸业有限公司。

循环水式多用真空泵:SHB-Ⅲ型,郑州长城科工贸有限公司;

电热恒温鼓风干燥箱:101FA-3型,上海申光仪器仪表有限公司;

电热恒温培养箱:HPP-9272型,北京东联哈尔仪器制造有限公司;

真空充气包装机:DZQ 550L型,杭州佑天元包装机械制造有限公司;

医疗型洁净工作台:DL-CJ-2F型,北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Mozzarella干酪的制作 参照文献[6]来制作 Mozzarella干酪。本试验根据所加入的发酵剂不同制备3种Mozzarella干酪。第1种是按原料乳量0.5%加入CH9和LB组成的混合发酵剂和0.5%的嗜酸乳杆菌,第2种是按原料乳量0.5%加入CH9和LB组成的混合发酵剂和0.5%的双歧杆菌,第3种是按原料乳量0.5%加入CH9和LB组成的混合发酵剂和0.5% 的植物乳杆菌。

1.2.2 Mozzarella干酪抗菌物质的提取

(1)无菌蒸馏水提取法:称取 Mozzarella干酪30g,切碎、研磨后放入烧杯中,加入100mL无菌蒸馏水,搅拌均匀后静置1h,将上清液用旋转蒸发仪蒸发到贴壁状态,然后用少量的无菌蒸馏水把贴壁物质溶解出来,倒入清洗干净并经过杀菌的小瓶中。

(2)醋酸-醋酸钠缓冲溶液提取法:称取 Mozzarella干酪30g,经切碎、研磨后放入烧杯中,然后向烧杯中加入100mL pH为4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,其余同无菌蒸馏水提取法。

(3)三氯乙酸溶液提取法:称取Mozzarella干酪30g,经切碎、研磨后放入烧杯中,然后向烧杯中加入100mL 12%的三氯乙酸溶液,其余同无菌蒸馏水提取法。

本试验在干酪成熟40,50,60d时分3次提取,每次提取时采用以上3种方式。

1.2.3 菌种活化与接种涂布 将经过灭菌的培养基装入试管后摆斜面,在无菌条件下用划线法将供试菌种移接入相应的斜面培养基上,于37℃ 培养18~24h,进行菌种斜面活化[7]。

取无菌培养皿,做标记后迅速倒入培养基20mL,并快速轻巧地晃动培养皿,平置冷却备用[8]。

分别在培养皿中用移液枪移取少量的无菌蒸馏水,滴到培养皿的中央,然后根据培养皿的标记接种枯草芽孢杆菌,接种时要将菌融在无菌蒸馏水中,然后用涂布器涂匀。

1.2.4 提取液抗菌活性的测定 参照文献[8~10]并做适当改进,采用滤纸片法测定提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用。

滤纸片法:用无菌镊子夹住灭菌后的滤纸片分别在不同的提取液中浸泡一下,在瓶口滤去多余样液,然后根据培养皿的标记贴到相应的位置,贴完后把培养皿放入37℃的恒温培养箱中培养24h。培养完成后,取出,观察抑菌效果和测量抑菌圈的直径。

1.2.5 空白的制作 分别量取100mL的无菌蒸馏水、pH为4.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和12%的三氯乙酸溶液,用旋转蒸发仪蒸发到贴壁状态,然后用少量的无菌蒸馏水把贴壁的物质溶解出来,倒入清洗干净并经过杀菌的小瓶中。根据培养皿的标记用滤纸片法测定3种空白提取液是否对试验结果造成影响。

2 结果与分析

2.1 添加嗜酸乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用

由图1可知,3种方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液对枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用。无菌蒸馏水提取的成熟期为40,50,60d添加嗜酸乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性相差不大,抑菌圈直径分别为1.00,0.98,1.01cm;用醋酸-醋酸钠缓冲溶液提取的成熟期为40d添加嗜酸乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为1.93cm;TCA提取的成熟期为40d添加嗜酸乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为2.78cm。

图1 添加嗜酸乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用Figure 1 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus acidophilus on Bacillus subtilis

2.2 添加双歧杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用

由图2可知,3种方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用。无菌蒸馏水提取的成熟期为40d添加双歧杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为1.18cm;用醋酸-醋酸钠缓冲溶液提取的成熟期为40d添加双歧杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为1.99cm;TCA提取的成熟期为60d添加双歧杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为3.05cm。

图2 添加双歧杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用Figure 2 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Bifidobacteriaon Bacillus subtilis

2.3 添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用

图3 添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用Figure 3 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumon Bacillus subtilis

图4 不同成熟期添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抗菌性Figure 4 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumduring different ripening on Bacillus subtilis

由图3、图4可知,3种方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液对枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用。无菌蒸馏水提取的成熟期为60d添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为1.25cm;用醋酸-醋酸钠缓冲溶液提取的成熟期为60d添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为2.18cm;TCA提取的成熟期为40d添加植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为3.28cm。

3 结论

(1)不同成熟期添加嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液对枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用。

(2)3种提取方法中,TCA提取法提取不同 Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用相对较好,其制备的提取液可能含有更多种类的抗菌肽。

(3)用TCA提取法提取出添加嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的Mozzarella干酪成熟40d时的提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径分别为2.78cm和3.28cm。

(4)用TCA提取法提取出添加双歧杆菌的 Mozzarella干酪成熟60d时的提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性最强,抑菌圈直径为3.05cm。

(5)添加嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌的Mozzarella干酪提取液主要含有酪蛋白,酪蛋白具有丰富的生物活性序列[11],酪蛋白抗菌肽通过破坏细胞膜结构、诱导细胞凋亡、抑制细胞呼吸和DNA合成等机制来达到抑制枯草芽孢杆菌的作用。随着干酪的成熟,酪蛋白在凝乳酶和发酵剂微生物产生的蛋白分解酶的作用下形成抗菌肽。添加嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌对Mozzarella干酪的成熟有一定的影响,从而影响抗菌肽的形成,同时,提取方法不同,提取液中所含的肽类不同或者浓度不同,从而对枯草芽孢杆菌的抗菌性不同,TCA提取法制备出的提取液可能含抗菌肽的浓度大或者种类多,抑菌圈直径较大。至于嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和植物乳杆菌对Mozzarella干酪提取液抗菌性的影响,还有待进一步的试验研究。

1 王欣,刘飞,霍贵成.传统乳制品中嗜酸乳杆菌的生理特性研究[J].东北农业大学学报,2008,39(9):87~92.

2 Corbo M R,Albenzio M,De Angelis M,et al.Microbiological and biochemical properties of canestrato pugliese hard cheese supplemented with bifidobacteria[J].Journal of Dairy Science,2001,84(3):551~561.

3 王水泉,包艳,董喜梅.植物乳杆菌的生理功能及应用[J].中国农业科技导报,2010,12(4):49~55.

4 郑俏然,李诚.胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白产物抑菌特性的研究[J].食品科技,2009,34(6):179~181.

5 杜军,袁永俊,侯恩娟,等.酪蛋白酶解物中抗菌肽的抑菌性及稳定性研究[J].中国乳品工业,2012,40(1):22~24.

6 刘会平,南庆贤,马长伟,等.不同工艺参数对Mozzarella干酪质构和功能特性的影响[J].中国食品学报,2006,6(2):20~28.

7 宗绪岩,李丽,罗惠波,等.啤酒糟蛋白水解物对金黄色葡萄球菌抑菌能力研究[J].食品与机械,2012,28(1):108~111.

8 赵玲,曹荣,刘淇,等.南极磷虾酶解提取液的抑菌活性[J].渔业科学进展,2011,32(4):112~116.

9 黄小炯,区子弁.银杏抗菌蛋白的提取及其抗菌性研究[J].食品工业科技,2008(10):139~145.

10 王元清,严建业,罗堃,等.蟾皮提取物抑菌活性与稳定性研究[J].食品与机械,2011,27(5):120~122.

11 袁永俊,胡婷,朱家骅,等.酪蛋白抗菌肽的酶法制备[J].食品与机械,2010,26(2):1~4.

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