大红袍与红茶对肠道菌群失衡的作用研究

金莉莎 刘仲华， 黄建安 蔡淑娴

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

古医书中早有记载茶叶对肠道疾病的预防和治疗作用［1］。现代茶医学研究［2，3］表明，茶叶具有改善肠道菌群、增强机体免疫力等多种保健养生功效。尽管不同茶类可能具有同一保健养生功能，但由于原料和加工工艺不同，品质风味与内含物质组成不同，其产生某一作用的效能及作用途径可能存在一定差异。大红袍是闽北乌龙茶的极品，属于半发酵茶，红茶是多酚氧化酶主导下的全发酵茶，长期的民间饮用实践表明，大红袍和工夫红茶都有一定的调理肠胃作用，但对它们的作用效果及作用途径尚缺乏深入的研究［4］。本试验采用大红袍和红茶提取冻干粉饲喂试验小鼠，然后利用抗生素类药物盐酸林可霉素诱导试验小鼠肠道菌群失衡及机体免疫功能紊乱，探讨茶叶对肠道菌群及机体免疫功能的调节效果，为大红袍和红茶的保健养生消费提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器与试剂

全自动生化分析仪：LABOSPECT003型，日本日立公司；

台式冷冻离心机：MIKRO 22R型，德国Hettich公司；

石蜡切片机：Leica RM2235型，德国徕卡公司；

生物显微镜：Leica DM2000型，德国徕卡公司；

酶 标 仪：Thermo Scientific Varioskan Flash 型，美 国Thermo公司；

冷冻干燥机：Modulyod－230型，美国 Thermo Fisher scientific公司；

旋转浓缩蒸发仪：BUCHI R－200型，瑞士BUCHI公司；

血清总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）测定试剂盒：上海科华生物科技有限公司；

血清IgG ELISA测定试剂盒：美国Cusabio公司；

盐酸林可霉素：300mg／mL，批号：H41020128，河南天方药业股份有限公司。

1.1.2 培养基

BBL培养基（培养双歧杆菌）、MRS基础培养基（培养乳杆菌）、EC琼脂培养基（培养肠球菌）及EMB培养基（培养肠杆菌）：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 供试材料

大红袍：老记大红袍，中国老记茶业集团；

红茶：文新信阳红（条形工夫红茶），河南省信阳文新茶叶有限公司。

1.1.4 试验动物及基础饲料

昆明小鼠：SPF级，雄性，体重20～25g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。试验动物生产许可证号：SCXK（湘）2011－0003。

动物基础饲料：湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模

（1）茶叶水提物的制备：试验时，沸水浸泡30min（1∶10（m∶V）茶水比），冷却后过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩后于冷冻干燥机中冻干。收集冻干茶粉，密封保存备用。两种茶叶水提物的主要品质成分含量见表1。

表1 茶叶水提物的主要品质成分含量Table 1 The content of main components of different tea extracts

（2）剂量配置：试验所选高、低剂量浓度分别为300，75mg／kg。每只小鼠的灌胃体积为0.3mL／d。

（3）试验动物组别设计：所有小鼠自由摄食、饮水，饲喂基础饲料，环境相对湿度控制在45%～60%，温度（20±5）℃。喂养3d让其适应饲喂方式与环境，3d后随机分为6组，每组10只小鼠，分别为正常对照组、模型对照组、大红袍低剂量组、大红袍高剂量组、红茶低剂量组、红茶高剂量组。开始8d，正常对照组和模型对照组灌胃生理盐水，其他4组分别灌胃相应的受试样品。第9天，茶叶4组除灌胃相应的受试物外，与模型组一起灌胃300mg／mL盐酸林可霉素，0.3mL每次，每天2次，正常对照组则灌胃等量生理盐水，连续5d，于最后1次给受试物24h后，无菌采集小鼠鲜粪便检测肠道菌群数量。试验结束后，处死小鼠。

1.2.2 肠道菌群检测 根据文献［5］，修改如下：用已灭菌的瓶子无菌采集小鼠鲜粪便，加无菌水递10倍稀释至10－8，在超净工作台上取1mL分别接种在各类培养基上，EC培养基、EMB培养基放入需氧培养箱37℃培养，BBL培养基、MRS培养基放入厌氧培养箱37℃培养。菌落长出后计数并计算每克粪便中各菌群的菌落形成单位（CFU／g）。

1.2.3 脾指数测定 小鼠处死前称量体重，处死后分离脾脏，称量脾脏重量。按式（1）计算脾指数。

1.2.4 血清中各指标的测定 血清总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）在全自动生化分析仪上进行检测，根据总蛋白、白蛋白的含量计算出血清球蛋白的含量。血清IgG含量按照ELISA试剂盒要求进行测定。

1.2.5 病理学检测 取小鼠结肠组织，HE染色，观察结果。

2 结果与分析

2.1 小鼠肠道菌群失调模型验证

模型组灌胃盐酸林可霉素5d后，小鼠行动缓慢、背毛竖起并出现腹泻的症状，立即采取鲜粪便进行菌落计数及统计分析（表2）。结果表明，模型对照组的肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌与正常对照组相比，有不同程度的减少，且存在着极显著差异（P＜0.01）。解剖正常对照组和模型对照组小鼠，发现模型对照组小鼠盲肠充血肿胀，肠壁变薄，内容物呈水状，上述结果证实通过灌胃盐酸林可霉素，成功建立了菌群失衡模型。

2.2 大红袍和红茶对盐酸林可霉素诱导小鼠肠道菌群失衡的影响

在小鼠灌胃盐酸林可霉素5d后，大红袍2个剂量组的菌群菌量与模型对照组小鼠相比存在极显著差异（P＜0.01），接近正常对照组的水平；红茶只有在高剂量时，肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌菌群菌量与模型对照组小鼠相比有显著差异（P＜0.05）。由此可见，大红袍和红茶在预防抗生素所致的肠道菌群紊乱方面具有一定的作用，且大红袍的预防效果优于红茶（表2）。

2.3 大红袍和红茶对试验小鼠脾指数、球蛋白和IgG的影响

脾指数、球蛋白含量和免疫球蛋白IgG含量是反映小鼠机体免疫功能的重要指标。由表3可知，大红袍2个剂量组和红茶2个剂量组的脾指数均高于模型对照组，但无统计学上的显著差异。大红袍2个剂量组和红茶2个剂量组的球蛋白含量与模型对照组相比均明显增加，且大红袍、红茶低剂量组与模型对照组有显著差异（P＜0.05），大红袍、红茶高剂量组与模型对照组存在极显著差异（P＜0.01）。大红袍2个剂量组和红茶2个剂量组的免疫球蛋白IgG含量均明显高于模型组，且均存在极显著差异（P＜0.01）。

表2 小鼠经盐酸林可霉素灌胃后肠道菌群的变化†Table 2 Change of intestinal flora in mice after feeding lincomycin hydrochloride ／（lg N·g－1）

表3 小鼠经盐酸林可霉素灌胃后脾指数、球蛋白和IgG的变化†Table 3 Change of spleen index，globulin and IgG in mice after feeding lincomycin hydrochloride

2.4 各组小鼠结肠切片的病理观察

由图1可知，正常小鼠结肠组织表面光滑，小肠绒毛粗大，肠黏膜上皮完整；模型组小鼠小肠绒毛充血、水肿，肠绒毛变平、变短、萎缩、倒伏，小肠绒毛轮廓不清，部分腺上皮脱落，可见炎性细胞浸润；大红袍低剂量组小鼠肠黏膜较完整，

图1 各组小鼠结肠切片图（100×）Figure 1 Colon section of mice in different groups（100×）

小肠绒毛变短，可见少量炎性细胞浸润；大红袍高剂量组小鼠结肠组织表面光滑，溃疡面恢复较好，小肠绒毛变长；红茶低剂量组小鼠肠绒毛变短、萎缩、轮廓不清，可见炎性细胞浸润；红茶高剂量组小鼠肠黏膜较完整，肠绒毛轮廓较清晰。从小鼠结肠切片可以清晰地看出，大红袍和红茶对抗生素药物盐酸林可霉素诱导的小鼠结肠组织病变均具有一定的预防作用，且高剂量较低剂量效果明显，同一剂量条件下，大红袍比红茶的效果要好一些。

3 讨论

石梅等［6］用抗生素混合液灌胃小鼠连续3d，小鼠肠道菌群失衡，脾指数、淋巴细胞转化率及血清免疫球蛋白IgG含量等均明显下降。刘崇海等［7］给小鼠口服抗生素后给予白色念珠菌，使其肠道菌群失衡后发现PHA诱导的淋巴细胞转化率、脾指数以及TLR2和TLR4基因表达水平与正常组相比均降低。这些均表明抗生素诱导的动物肠道菌群失衡可致机体免疫功能紊乱或低下。

本试验采用盐酸林可霉素诱导小鼠肠道菌群失衡，模型组小鼠表现出肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌菌量大幅度减少，脾指数、血清球蛋白含量、免疫球蛋白IgG含量均下降，肠绒毛损伤严重。然而，使用大红袍和红茶提取物饲喂预防后，尤其是高剂量使用后，这种由盐酸林可霉素引起的小鼠肠道菌落失衡、机体免疫功能紊乱及结肠组织病变等现象得到明显抑制。这说明在使用抗生素的同时饮用大红袍和红茶，对预防肠道菌群失衡和机体免疫功能紊乱方面具有一定的作用，且在等剂量条件下大红袍的效果优于红茶。从表1大红袍和红茶水提物的主要品质成分含量中，可以看出大红袍的茶多酚和茶多糖含量均高于红茶，且有研究［8］表明，茶多酚能提高小鼠肠道中的双歧杆菌含量，所以大红袍预防肠道菌群失衡的效果优于红茶可能与这些成分有关，但其作用机理还需进行进一步的研究。

1 陈宗懋.茶对人体肠道免疫功能的影响［J］.中国茶叶，1995（5）：26～27.

2 Wolfram S，Wang Y，Thieleeke F.Anti－obesity effects of green tea：From bedside to bench［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（2）：176～187.

3 Kao Y H，Chang H，Lee M J.Tea，obesity，and diabetes［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（21）：188～210.

4 徐仲溪，王坤波.茶多糖化学及生物活性研究［J］.茶叶科学，2004，24（2）：75～81.

5 张燕，罗予.加味四君子汤对小鼠肠道免疫功能调整作用的研究［J］.时珍国医国药，2010，21（5）：1 181～1 183.

6 石梅，彭广能，钟志军，等.思密达对实验性小鼠肠道菌群及免疫功能影响的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2007（11）：88～89.

7 刘崇海，杨锡强，刘恩梅，等.抗生素诱导小鼠肠道菌群失调对免疫功能和Toll样受体2、4基因表达的影响［J］.重庆医科大学学报，2007，32（8）：839～842.

8 王玮，曾本华，李桂花，等.茶多酚对apoE－／－－小鼠脂类代谢和肠道双歧杆菌的影响［J］.食品与机械，2012，28（4）：106～109.