粪便基因型检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的研究*

秦幼娟 周晓颖 赵 冰 刘 伟 潘晓林 张国新

南京医科大学第一附属医院消化科(210029)

幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因子，与胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关，1994年世界卫生组织国际癌症研究机构将Hp定为Ⅰ类致癌原［1］。含克拉霉素的三联或四联疗法是目前最常用的Hp根除方案，但随着抗菌药物的广泛使用，Hp耐药日趋严重，对克拉霉素耐药是Hp根除失败的主要原因之一。选择快速、敏感、价廉的耐药检测方法对根除Hp具有重要意义。近年来分子生物学技术广泛用于Hp耐药基因的检测，有研究［2］表明Hp对克拉霉素耐药与Hp 23S rRNA V区点突变有关。本研究通过评价检测粪便Hp基因突变对诊断克拉霉素耐药的有效性，并探讨cagA基因与耐药的相关性，旨在探索一种快速、简便的Hp耐药检测方法。

对象与方法

一、研究对象

选取2012年1～10月南京医科大学第一附属医院经13C-尿素呼气试验证实Hp感染的患者74例，其中男36例，女38例;年龄25～72岁，平均(49.4±5.6)岁;慢性胃炎50例、胃十二指肠球部溃疡18例、胃癌6例。74例患者均来自南京地区。排除标准:①过去4周内曾服用抗菌药物、铋剂、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂;②胃、十二指肠球部溃疡出血、穿孔;③妊娠或哺乳期妇女;④以往接受过Hp根除治疗。采集患者新鲜粪便，2 h内进行检测或－80℃保存待测。本研究方案经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.DNA提取:取适量粪便标本，采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)(北京百泰克生物技术有限公司)提取DNA，具体操作步骤参照说明书进行。以Hp标准菌株悉尼菌株(上海市消化疾病研究所惠赠)作为阳性对照，以去离子水作为阴性对照。

2.巢式PCR法扩增:①第一轮扩增Hp 23S rRNA V区493 bp:Hp 23S rRNA 1835F:5’-GGT CTC AGC AAA GAG TCC CT-3’(1835 ～ 1854)，2327R:5’-CCC ACC AAG CAT TGT CCT-3’(2327 ～ 2310)。PCR 反应体系 50 μL，包括25 mmol/L MgCl24 μL、10 × PCR 缓冲液5 μL、上下游引物各1 μL、dNTPs 1 μL、Taq 酶 3 μL、模板 DNA 2 μL 以及无菌去离子水33 μL。反应条件:95℃预变性2 min;94℃变性30 s，57 ℃ 退火 37 s，72 ℃ 延伸 30 s，5 个循环;94 ℃ 变性15 s，57 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸20 s，30 个循环。

②第二轮扩增Hp 23S rRNA V区367 bp:Hp 23S rRNA 1942F:5’-AGG ATG CGT CAG TCG CAA GAT-3’(1942 ～1962)，2308R:5’-CCT GTG GAT AAC ACA GGC CAG T-3’(2308～2287)。PCR反应体系50 μL，包括第一轮扩增产物2 μL、25 mmol/L MgCl24 μL、10 × PCR 缓冲液 5 μL、上下游引物各1 μL、dNTPs 1 μL、Taq 酶 3 μL 等。反应条件:95 ℃预变性2 min;94℃变性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，25个循环;72℃延伸7 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。所有阴性标本加入β-actin引物扩增838 bp片段，反应体系同上，反应条件:95℃预变性1 min;95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸7 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

3.PCR-RFLP检测:取8 μL第二轮PCR产物分别加入限制性内切酶BbsⅠ、BceAⅠ［纽英伦生物技术(北京)有限公司］，37℃孵育24 h;取8 μL第二轮PCR产物加入限制性内切酶BsaⅠ［纽英伦生物技术(北京)有限公司］，50℃孵育24 h。酶切后取5 μL反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，若存在A2142G、A2142C、A2143G突变，突变位点即可分别被BbsⅠ、BceAⅠ、BsaⅠ酶切为两个片段。

4.DNA测序:根据PCR-RFLP酶切结果，随机选取2例野生型(未被酶切)和8例突变型(被酶切)标本的PCR产物，由华大基因有限公司纯化后测序。

5.PCR 扩增 cagA 349 bp:cagA F:5’-GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G-3’，R:5’-CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A-3’。PCR反应体系同步骤①。反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，40个循环;72℃延伸7 min。取5 μL PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。

三、统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件，所得数据以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Hp 23S rRNA PCR扩增结果

74例Hp阳性患者的粪便标本中，49例经PCR扩增得到Hp 23S rRNA 493 bp片段，扩增率为66.2%，60例扩增得到Hp 23S rRNA 367 bp片段，扩增率为81.1%。阴性标本加入β-actin引物后均扩增出838 bp片段。

二、Hp 23S rRNA PCR-RFLP检测结果

对60例Hp 23S rRNA扩增阳性产物进行酶切，结果显示17例(28.3%)被 BsaⅠ酶切(见图 1)，60例均未被BbsⅠ、BceAⅠ酶切。阳性对照均未被 BsaⅠ、BbsⅠ、BceAⅠ酶切。

三、cagA PCR扩增结果

60例Hp 23S rRNA扩增阳性标本中，46例cagA阳性表达，阳性率为76.7%，其中13例被 BsaⅠ酶切，突变率为28.3%;14例cagA阴性表达，其中4例被BsaⅠ酶切，突变率为28.6%，cagA阳性、阴性表达的突变率相比差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.98)。

图1 BsaⅠ酶切Hp 23S rRNA产物图

四、DNA测序

随机选取的2例野生型和8例突变型标本的测序分析结果与基因组数据库NCBI的Hp26695株(NC-000915)23S rRNA基因序列进行比较，结果显示被酶切开的标本发生A2143G突变。

讨 论

克拉霉素属于大环内酯类，是根除Hp的有效抗菌药物之一，其抗菌机制为药物进入细胞内与核糖体紧密结合，作用于23S rRNA的多肽转移环，抑制多肽转移酶，阻止肽链延长，从而抑制蛋白质合成。克拉霉素耐药严重影响Hp根除疗效，而根除失败亦可导致克拉霉素耐药率增加。因此，临床上亟需一种快速、准确诊断Hp对克拉霉素耐药的方法。

Hp对克拉霉素耐药与其23S rRNA V区点突变有关，在此基础上开展快速、准确的Hp耐药检测可用于指导临床治疗，提高Hp根除疗效。目前发现的Hp 23S rRNA突变类型包括 A2143G、A2142G、A2142C、A2142T、A2143C、G2115A、G2141A，其中A2143G突变最为常见且稳定，占所有突变的45.1% ～82.1%，亦 存 在 A2143G+A2142G、A2143G+A2142C双重突变［3］。Hp对克拉霉素耐药的分子学检测方法主要立足于检测其23S rRNA点突变，基因测序是最准确的方法，但费时费力。目前应用最多的是PCR-RFLP检测，此方法检测点突变较为敏感，且简便易行，是检测A-G突变的基本方法，最早于1996年Versalovic等［2］应用此方法检测到Hp 23S rRNA A2142G、A2143G 突变。Ménard等［4］的研究发现，应用限制性内切酶BceAⅠ对PCR产物进行酶切，可检测23S rRNA A2142C突变。

Hp对克拉霉素的敏感性检测应本着可靠、简单、便于实施和推广的原则。粪便取材方便且无痛苦、无创伤、经济成本低。Hp定居于胃黏膜上皮细胞表面，可随胃黏膜上皮细胞更新脱落伴粪便排出。1994年Kelly等［5］从消化不良患者的粪便中分离出Hp。1995年Namavar等［6］应用16S rDNA PCR和DNA杂交技术从粪便中检测到Hp。1997年Kurokawa等［7］应用细菌培养和PCR两种方法检测粪便中Hp，发现PCR敏感性较细菌培养高，但粪便中Hp含量较低，杂菌较多，尤其是粪便中的胆红质、胆盐以及重金属离子等可抑制Taq DNA聚合酶活性，去除上述干扰因素是实验成功的关键。

本研究采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒提取粪便DNA，PCR扩增率为81.1%，在研究中为避免假阴性，对所有阴性标本加入β-actin进行第二次扩增，均得到了838 bp的产物，说明此试剂盒能快速提取高质量DNA，不存在抑制物造成的假阴性。同时，本研究采用巢式PCR法行两次PCR扩增，克服了扩增平台期效应的限制，从而提高了PCR扩增敏感性，并由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应放大的可能性，保证了反应的特异性。此外，本研究缩短了扩增时间，使检测更迅速。

本研究对60例Hp 23S rRNA阳性扩增产物进行酶切，17例可被BsaⅠ酶切，但均未被BbsⅠ、BceAⅠ酶切，提示与克拉霉素耐药有关的23S rRNA V区发生A2143G突变，不存在A2142G、A2142C突变。同时随机抽取2例野生型和8例突变型标本检测23S rRNA序列，结果证实对克拉霉素耐药的标本均存在A2143G突变。综合PCR-RFLP检测结果和基因序列比对结果，提示江苏地区Hp对克拉霉素的耐药机制主要为23S rRNA A2143G突变。

cagA是Hp的重要毒力因子，可作为评价Hp毒力的指标。根据是否表达cagA可将Hp分为Ⅰ型菌株(表达cagA基因)、Ⅱ型菌株(不表达cagA基因)，Ⅰ型菌株产细胞毒素，为高毒力Hp菌株。本研究60例Hp 23S rRNA扩增阳性标本中46例cagA阳性表达，阳性率为76.7%，Hp感染以cagA基因阳性菌株为主，但cagA阳性、阴性表达者的突变率相比差异无统计学意义，提示cagA基因与Hp对克拉霉素耐药不相关。

综上所述，粪便取材方便、无痛苦、无创伤，用巢式PCR法提取粪便DNA，扩增Hp 23S rRNA，并检测Hp感染以及23S rRNA点突变是判断Hp对克拉霉素耐药的有效方法，尤其适用于流行病学调查研究。未来有待进一步研究以建立Hp耐药的流行病学资料，指导临床合理用药根除Hp。

1 Lai CH，Kuo CH，Chen PY，et al.Association of antibiotic resistance and higher internalization activity in resistant Helicobacter pylori isolates［J］.J Antimicrob Chemother，2006，57(3):466-471.

2 Versalovic J，Shortridge D，Kibler K，et al.Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori ［J］.Antimicrob Agents Chemother，1996，40(2):477-480.

3 de Francesco V，Margiotta M，Zullo A，et al.Primary clarithromycin resistance in Italy assessed on Helicobacter pylori DNA sequences by TaqMan real-time polymerase chain reaction［J］.Aliment Pharmacol Ther，2006，23(3):429-435.

4 Ménard A，Santos A，Mégraud F，et al.PCR-restriction fragmentlength polymorphism can also detectpoint mutation A2142C in the 23S rRNA gene，associated with Helicobacterpyloriresistance to clarithromycin［J］.Antimicrob Agents Chemother， 2002， 46 (4):1156-1157.

5 Kelly SM，Pitcher MC，Farmery SM，et al.Isolation of Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom［J］.Gastroenterology，1994，107(6):1671-1674.

6 Namavar F，Roosendaal R，Kuipers EJ，et al.Presence of Helicobacter pylori in the oral cavity，oesophagus，stomach and feces of patients with gastritis［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1995，14(3):234-237.

7 Kurokawa M，Minamide M，Nukina M，et al.Usefulness of Helicobacter pylori detection from feces specimens of the patients with peptic ulcer by polymerase chain reaction［J］.Kansenshogaku Zasshi，1997，71(11):1168-1171.