表皮生长因子及其受体对结肠癌干细胞的增殖调控*

冯燕君 刘 倩 方 一 宋荣峰 万以叶刘建胜 王海伟 杜艳芝 张 济 夏 璐＆

上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科1(200025) 江西省肿瘤医院肿瘤内三科2中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院健康科学研究所基因组学3

传统理论认为肿瘤是均一的细胞团体，是所有肿瘤细胞共同增殖的结果，而肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)假说认为肿瘤为一异质体，其中存在一小部分干细胞特性的肿瘤干细胞，具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力，是肿瘤生长、复发、转移、耐药的根源［1］。目前，已在急性髓细胞样白血病、乳腺癌、头颈部癌、胰腺癌、结直肠癌等多种肿瘤中分离、鉴定出 CSCs［2～6］。肿瘤细胞生长需特定微环境，细胞因子在其中发挥重要作用。肠道干细胞在增殖过程中，可通过分泌生长因子如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，维持自身生长并抑制凋亡［7，8］。已知 EGF对 CSCs生长具有一定调控作用，Soeda等［9］的研究显示，EGF可促进脑CSCs增殖。然而，关于EGF对结肠癌干细胞增殖的影响尚未见报道。本研究通过探讨EGF及其受体(EGFR)在结肠癌干细胞增殖调控中的作用，以期为结肠癌的治疗提供新思路。

材料与方法

一、细胞株、实验动物和主要试剂

结肠癌细胞株HT29、HCT116(中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所基因实验室保存);健康清洁级雄性BALB/c(nu/nu)小鼠6只(复旦大学上海医学院动物实验室提供)。RPMI1640、DMEM/F12、4%BSA、0.05%EDTA-胰酶、Trizol试剂(Gibco公司);B27、胰岛素样生长因子(IGF)、MTT、DMSO(Sigma公司);EGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeproTech公司);吉非替尼(Tocris Bioscience公司);PD153035(Merck公司);Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒(BD公司);鼠抗兔Ki67单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司);Real-Time PCR试剂盒(Qiagen公司)。

二、方法

1.细胞株和细胞球培养:结肠癌细胞株HT29、HCT116传代培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中。取对数生长期细胞，以1×103/mL接种于由 DMEM/F12(1∶1)、B27(1∶50)、4%BSA(1∶10)、EGF(20 ng/mL)、bFGF(20 ng/mL)组成的无血清培养基(SFM)中培养。

2.生长因子干预细胞:取HT29、HCT116细胞在SFM中形成的细胞球，以0.05%EDTA-胰酶消化，制成单细胞悬液。将细胞以1×103/mL接种于96孔板，分别以20 ng/mL EGF、bFGF、IGF 干预，同时设立空白对照组。5～7 d后显微镜下计数每孔细胞球数。

3.MTT法检测细胞增殖抑制:取HCT116细胞球，制成单细胞悬液，以1×106/mL接种于96孔板，分别加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L)EGFR抑制剂吉非替尼，于5%CO2、37℃条件下培养72 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养 4 h，终止培养，弃MTT溶液，加入DMSO 20 μL溶解紫色结晶，以酶标仪行分光光度检测，于570 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，绘制生长曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。

4.体外增殖实验检测细胞球形成抑制:取HCT116细胞球，制成单细胞悬液，以1×103/mL接种于96 孔板，分别加入不同浓度(0、1、5、10、15、20 μmol/L)吉非替尼，另一96孔板加入EGFR抑制剂PD153035(浓度同吉非替尼)，于5%CO2、37℃条件下培养72 h，显微镜下计数每孔细胞球数。

5.流式细胞术检测细胞凋亡:取HCT116细胞球，制成单细胞悬液，分别加入不同浓度(0、1、5、10、15 μmol/L)吉非替尼，培养 72 h，加入 Annexin V-FITC和PI染色液，混匀后室温避光静置15 min，上流式细胞仪检测。

6.小鼠体内成瘤实验检测细胞成瘤能力:取HCT116细胞球和RPMI1640培养基中贴壁生长的HCT116细胞，制成单细胞悬液，小鼠右侧腋窝皮下接种由细胞球制成的单细胞悬液(1×105个细胞)，同只小鼠左侧腋窝皮下接种由细胞株制成的单细胞悬液(1×105个细胞)，观察小鼠两侧成瘤率以及皮下移植瘤生长速度，瘤体直径≥5 mm起开始测量移植瘤体积，体积=长径×短径2/2，绘制移植瘤生长曲线。

取小鼠皮下移植瘤行HE染色、免疫组化SABC法染色。肿瘤组织石蜡包埋、切片，脱蜡至水，以3%H2O2室温孵育，5%山羊血清封闭，室温孵育，加入鼠抗兔Ki67单克隆抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜，PBS冲洗，加入生物素标记的二抗(1∶10 000)，37℃孵育30 min，PBS冲洗，加入HRP标记的链霉卵白素(1∶10 000)，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB或AEC显色，自来水冲洗，复染，封片，摄片。

7.Real-time PCR:参考 Barker 等［10］、Kayahara等［11］、Chan 等［12］的研究，检测干细胞标记 LGR5、Musashi-1和分化标记CK20在HCT116细胞球和细胞株中的表达。取 HCT116细胞球和贴壁细胞，Trizol法提取RNA，逆转录合成cDNA。LGR5引物上游:5’-CTC CCA GGT CTG GTG TGT TG-3’，下游:5’-GTG AAG ACG CTG AGG TTG GA-3’;Musashi-1引物上游:5’-GGA CTC AGT TGG CAG ACT ACG-3’，下游:5’-CTG GTC CAT GAA AGT GAC GAA-3’;CK20引物上游:5’-ATG GAT TTC AGT CGC AGA AGC-3’，下游:5’-CTC CCA TAG TTC ACC GTG TGT-3’;GAPDH 引物上游:5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’，下游:5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’。参照Real-Time PCR试剂盒说明书进行操作。反应体系总体系10 μL，反应条件:95℃ 60 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃45 s，共 40 个循环;最后 72 ℃ 延伸 5 min。2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、生长因子对结肠癌细胞球形成的影响

在无血清培养基中，HCT116、HT29细胞均能形成细胞球(见图1A、1B)。HCT116细胞球数量在空白对照组、EGF组、bFGF组、IGF组分别为(25.30±2.14)/孔、(41.78 ± 2.75)/孔、(26.33 ± 1.66)/孔、(27.22 ±2.66)/孔，EGF 组较其余各组显著升高(P＜0.05)(见图1C)。HT29细胞球数量在四组间差异无统计学意义(P＞0.05)(见图1D)。

二、EGFR抑制剂抑制结肠癌细胞球细胞增殖

MTT 法检测结果显示，不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L)吉非替尼作用于 HCT116 细胞球细胞后，细胞增殖受抑，增殖率随药物浓度增加而降低，浓度达1 μmol/L后，增殖抑制尤为明显(见图2)。IC50值为(12.5 ±0.48)μmol/L。

图1 生长因子对结肠癌细胞球形成的影响

图2 吉非替尼抑制HCT116细胞球细胞增殖

三、EGFR抑制剂抑制结肠癌细胞球形成

体外增殖实验结果显示，吉非替尼对HCT116细胞球形成具有抑制作用，作用随药物浓度增加而增强，浓度为15 μmol/L时抑制效应最大(见图3A)。PD153035的抑制作用与吉非替尼相似，浓度为20 μmol/L时抑制效应最大(见图3B)。

四、EGFR抑制剂诱导结肠癌细胞球细胞凋亡

流式细胞分析结果显示，不同浓度(0、1、5、10、15 μmol/L)吉非替尼作用于 HCT116细胞球细胞后，细胞凋亡率随药物浓度增加而增加，1 μmol/L与15 μmol/L组间差异显著(P ＜0.05)(见图4)。

图3 EGFR抑制剂抑制HCT116细胞球形成

图4 吉非替尼诱导HCT116细胞球细胞凋亡

五、结肠癌细胞球和细胞株体内成瘤能力

小鼠体内成瘤实验结果显示，HCT116细胞球成瘤时间较HCT116细胞株显著缩短，接种18 d后，细胞球成瘤体积显著大于细胞株(P＜0.05)(见图5)。

HCT116细胞球和细胞株移植瘤HE染色、免疫组化染色结果显示，两种移植瘤的肿瘤细胞排列、核异型性和Ki67表达无明显差异(见图6)。

图5 HCT116细胞球和细胞株体内成瘤能力比较

六、结肠癌细胞球和细胞株干细胞标记、分化标记表达

Real-time PCR检测结果显示，干细胞标记LGR5、Musashi-1在HCT116细胞球中的表达显著高于HCT116细胞株，而分化标记CK20在细胞株中的表达显著高于细胞球(P＜0.05)(见图7)。

图6 HCT116细胞球和细胞株移植瘤HE染色和免疫组化染色

图7 HCT116细胞球和细胞株干细胞标记、分化标记表达比较

讨 论

既往对于肿瘤来源的研究多集中于癌细胞基因突变或表达异常，但肿瘤基因具有结构不稳定性、时间、空间依赖性以及个体差异性等特点，寻找具有肿瘤共性和特异性的基因难度较大。随着科学的发展，研究人员发现肿瘤细胞在增殖、分化方面与干细胞极为相似，提出肿瘤可能是一种干细胞疾病的理论［13］。

CSCs、肿瘤前体细胞和分化的肿瘤细胞是一个处于动态平衡的共存体。目前无血清培养法是经典的体外富集CSCs的方法，无血清环境能有效抑制细胞分化，使肿瘤细胞维持于CSCs状态。CSCs的“干”性主要表现为表达干细胞标记分子、启动肿瘤发生和参与肿瘤形成，即致瘤性。致瘤性的鉴定主要通过将细胞接种于免疫缺陷小鼠体内，观察一定时间内其在小鼠体内形成移植瘤的情况，此方法是鉴别CSCs的金标准。本研究体内成瘤实验结果显示，HCT116细胞球在体内形成移植瘤的能力明显强于HCT116细胞株。进一步对两种细胞形成的移植瘤进行HE染色和免疫组化染色，发现两种移植瘤的肿瘤细胞排列、核异型性和Ki67表达无明显差异，提示HCT116细胞球和细胞株形成的移植瘤均来源于HCT116干细胞。细胞球形成的移植瘤体积显著大于细胞株，说明细胞株的结肠癌干细胞数量少于细胞球。此外，干细胞标记鉴定结果显示，HCT116细胞球中的LGR5、Musashi-1表达水平显著高于HCT116细胞株，故推测无血清培养获得的肿瘤细胞球是CSCs的聚集体。

EGF是一种作用十分广泛的生长因子，通过与EGFR结合而发挥作用。研究［7］显示EGF等生长因子能促进肠道干细胞增殖，抑制肠道祖细胞凋亡。在CSCs的培养中，EGF、bFGF等生长因子已作为常规物质添加至培养基中。对头颈部癌、前列腺癌的研究［14，15］证实，EGF、EGFR 在调节 CSCs 增殖过程中发挥重要作用。

EGFR是细胞表面ErbB受体家族中的一员，参与细胞增殖、生长、迁移、浸润等过程。研究［16］发现EGFR能通过唾液酸化作用调节EGF介导的结肠癌细胞增殖以及对吉非替尼的耐药性。本研究结果显示EGF对结肠癌干细胞增殖具有促进作用;证实EGF参与了结肠癌干细胞的增殖调控。进一步采用EGFR抑制剂吉非替尼、PD153035处理无血清培养条件下形成的HCT116细胞球，结果发现两者对细胞球形成具有明显抑制作用，同时发现EGFR抑制剂系通过诱导细胞凋亡而发挥增殖调控作用。Bae等［17］的研究发现，EGFR抑制剂可通过诱导结肠癌细胞表达UL16结合蛋白1(ULBP1)，增强其对自然杀伤(NK)细胞的敏感性。本研究结果显示，EGFR抑制剂对HCT116细胞球的增殖抑制和诱导凋亡作用可能与调节LGR5、Musashi-1和CK20表达有关。Zvibel等［18］的研究发现，培养于肝细胞外基质(hECM)中的具有高转移能力的结肠癌细胞，其干细胞标记LGR5表达显著升高。Walker等［19］的研究显示，结肠癌细胞敲除LGR5基因后，其克隆增殖、侵袭以及成瘤能力显著降低。

综上所述，本研究结果证实EGF对结肠癌细胞株HCT116、HT29形成细胞球具有促进作用;EGFR抑制剂可抑制结肠癌细胞球增殖并诱导细胞凋亡，相关作用可能与调控干细胞标记LGR5、Musashi-1和分化标记CK20表达有关。对结肠癌干细胞有待作更深入的研究，以明确其生物学功能，为结肠癌的治疗提供新思路。

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