神经调节因子Neuregulin-1及其受体ErbB2、ErbB4在恒河猴大脑、小脑的表达及分布

张庆慧 黄佩芝 梅金平 刘 洋 余 洋 赵炜疆▲

1.汕头大学医学院神经科学中心，广东汕头 515041;2.天津中医药大学研究生院，天津 300193

神经调节因子Neuregulin－1 （Nrg1）最初从乳腺癌肿瘤细胞中提取，是NRG1基因选择性剪切编码的类表皮生长因子家族重要成员之一[1]；Nrg1又称作胶质细胞生长因子（GGF），从牛脑和垂体中提取，体外条件下具有促有丝分裂活性[2]。 Nrg1基因选择性剪切产生至少6种Nrg1异形体，其中最主要的有Ⅰ到Ⅲ型Nrg1[3]。

ErbB3和ErbB4受体可直接与Nrg1发生作用，作用形式包括同二聚体：ErbB3/ErbB3和ErbB4/ErbB4以及异二聚体形式：ErbB3/ErbB2和ErbB4/ErbB2[4]。Nrg1与其受体相互作用可激活 ERK、AKT、MAPK， PI3γ、PKC 和 Jak-STAT信号，进而引起细胞周期改变、细胞分化、抗凋亡程序启动和肿瘤形成[5-7]。在发育中的大鼠脑组织中，Nrg1的表达可见于灰质、下丘脑以及小脑。成年期，Nrg1则表达于更广泛的脑组织区域，包括下丘脑、海马、基底节以及脑干[7-8]。 Nrg1与其受体ErbB2，ErbB3和ErbB4二聚体复合物相互所用，参与了一系列生物学过程[9-12]。 有报道，Nrg1受体表达于下丘脑星形细胞，在Nrg1旁分泌作用下激活，分泌前列腺素E2，进而刺激黄体生成素释放激素（LHRH）的释放，参与性成熟[7-8]。新近研究发现，Nrg1可表达于垂体促性腺激素细胞，并以邻分泌方式激活泌乳素细胞表面受体磷酸化，促进泌乳素释放[10-12]。 体外条件下，Nrg1还可促进乳腺癌细胞的侵袭，通过自分泌或旁分泌方式调节肌动蛋白细胞骨架，促进癌细胞转移[13-14]。

Nrg1已用于恒河猴体内疾病模型研究，如心律失常诱导的心功能衰竭，且重组Nrg1可增加健康猕猴心脏体积[15-17]。Nrg1还可通过提高PKB和Bcl-xl活性来对抗恒河猴心脏衰竭过程中心动过速诱导的心肌细胞凋亡[16]。此外，Nrg1受体ErbB2，ErbB3及 ErbB4 mRNA表达可广泛见于青年及成年期恒河猴大脑组织[17]。本研究比较观察Nrg1及其受体ErbB2、ErbB4在成年期恒河猴大脑及小脑灰质、白质中表达与分布，从而促进对Nrg1/ErbB信号通路在大脑、小脑中功能的了解。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠抗Nrg1抗体购自美国Thermo Scientific公司，兔抗ErbB2及兔抗ErbB4抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；抗小鼠DylightTM488及山羊抗兔DylighTMt594购自美国Jackson ImmunoResearch公司。DAPI染液及抗荧光衰减封片剂购自江苏碧云天生物技术研究所。苏木精及伊红染液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。含有恒河猴大脑及小脑组织的组织芯片购自陕西超英生物技术有限公司。

1.2 HE染色

4 μm厚恒河猴垂体组织微阵列切片脱蜡、水化，然后入苏木精液染色约2 min，1%盐酸酒精分化；之后行伊红染色，脱水、透明及中性树胶封片。

1.3 免疫荧光染色

4 μm厚恒河猴组织微阵列切片脱蜡、水化，然后入pH 9.0枸橼酸盐缓冲液中80℃抗原修复50 min。室温冷却后，切片入PBS中浸泡5 min，10%驴血清室温封闭60 min，然后加入小鼠抗Nrg1以及兔抗ErbB2抗体或小鼠抗Nrg1及兔抗ErbB4抗体（稀释比例分别为1∶100）混合液4℃孵育过夜。 PBS洗后，加驴抗小鼠DylightTM488二抗和山羊抗兔DylightTM594二抗（稀释度均为1∶500）混合液于切片上，室温孵育1 h。PBS轻洗后行DAPI染色5 min，PBS充分洗涤，并使用抗荧光衰减封片液封片，荧光显微镜（德国Zeiss，AXIO IMAGER Z1）下观察并采集图像。

2 结果

2.1 Nrg1及其受体ErbB2、ErbB4在恒河猴大脑皮质及白质中表达与分布

H&E染色显示恒河猴大脑皮质（图1-A）及白质基本结构 （图1-B）。免疫荧光双标法显示Nrg1可与其受体ErbB2或ErbB4可共位表达于恒河猴大脑皮质部分细胞胞体中，且均呈密集点状分布（图2）；而在大脑白质神经纤维集中区域三种分子均有分布，但Nrg1仅与ErbB4存在明显共定位（图3）。

2.2 Nrg1及其受体ErbB4在恒河猴小脑皮质及白质中表达与分布

H&E染色显示恒河猴小脑皮质（图4-A）及白质基本结构（图4-B）。免疫荧光显示Nrg1主要表达于小脑数量较多的颗粒细胞中并广泛分布于白质神经纤维，荧光双标显示Nrg1与其受体ErbB2可共定位于颗粒细胞及白质神经纤维。其受体ErbB4在小脑皮质及白质中无明显表达和分布，未见与Nrg1存在明显共定位（图5）。

3 讨论

Nrg1/ErbB受体通路在器官发育、细胞分化以及肿瘤发生中具有重要作用。有报道，Nrg1参与下丘脑神经元胶质细胞间通讯，促进下丘脑LHRH释放，从而诱导大鼠垂体促性腺激素释放和正常性成熟[7]。以往研究发现重组Nrg1α可诱导垂体细胞ErbB3受体磷酸化以及ErbB3受体的内源性磷酸化激活[18]，提示Nrg1/ErbB受体通路可能是多种生理和病理条件下重要信号通路的起点，此外还发现Nrg1与其受体ErbB4可部分表达于恒河猴垂体前叶两邻近细胞中[11]，说明在高等动物垂体组织中存在以Nrg1及其受体信号通路为基础的旁分泌和邻分泌机制。因此，明确高等动物中Nrg1及其受体表达与分布，对进一步研究Nrg1/ErbB受体信号在高等动物中枢神经系统中的作用具有重要意义。

本研究发现在恒河猴皮质Nrg1与ErbB2及ErbB4均存在明显共定位，提示Nrg1/ErbB受体信号通路在成年高等动物脑组织中具有重要作用，且Nrg1信号通路可能是以旁分泌或自分泌方式，通过ErbB2/ErbB4或ErbB4/ErbB4受体复合物实现的。在大脑白质神经纤维中仅观察到Nrg1与ErbB4共定位，表明在白质ErbB4/ErbB4是介导Nrg1功能的主要受体复合物形式。与大脑皮质及白质不同，小脑皮质及白质主要表达ErbB2,并与Nrg1共定位。这一结果提示，在恒河猴小脑中ErbB2/ErbB4不是介导Nrg1功能的主要受体复合物形式，ErbB2可能与表皮生长因子受体家族其他成员如表皮生长因子受体（EGFR）共同组成受体复合物介导Nrg1的功能，这一假设有待进一步研究支持。

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