提取柿叶黄酮类化合物工艺研究

卫静莉，薛笑莉，陈玉章

（太原工业学院化学与化工系，山西太原 030008）

提取柿叶黄酮类化合物工艺研究

卫静莉，薛笑莉，陈玉章

（太原工业学院化学与化工系，山西太原 030008）

摘 要：研究3种不同浸取柿叶黄酮类物质的工艺方法及优化工艺参数，通过正交试验，得出超声波水提法、超声波溶剂提取法和微波溶剂提取法的最佳工艺条件，3种方法在最佳工艺条件下的黄酮类物质提取量依次为5.28%、6.19%和6.15%；超声波水提法经济适用，适合生产化，超声波溶剂提取法和微波溶剂提取法所得提取黄酮类物质较高，比超声波水提法高出约0.8%。

关键词：柿叶；黄酮类物质；超声；微波；正交试验

柿叶中含有黄酮类、VC、三萜类、有机酸类、香豆素类、生物碱等多种生理活性物质和营养物质。黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等作用。因此，对柿叶中的黄酮类成分进行提取分离研究具有较大实用价值。我国地域辽阔，有着大量的柿叶资源，对柿叶进行综合开发利用，从中提取分离出黄酮类化合物以造福于人类，具有广阔的市场前景[1-2]。

对于从植物中提取有效成分有不同方法，不同提取工艺所得其黄酮类物质提取量、经济效益不同。本文通过对超声波水提法、超声波溶剂提取法、微波溶剂提取法进行研究比较，以总黄酮提取量为指标，分别采用单因素考察和正交试验,得出经济、适宜的柿叶黄酮类物质的提取方法及工艺,为柿叶的经济开发以提供技术支持。

1 仪器、材料与试剂

1.1 主要仪器

高效液相色谱仪[P－1201泵、UV－1201紫外检测器（有内置工作站）、SP自动进样器]：大连依科特公司；KQ-2200DB数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；RE-85Z旋转蒸发仪：巩义市英峪予华仪器厂制造；722型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；WP700（MS-2014T）LG微波炉：乐金电子天津电器有限公司制造；循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.2 材料与试剂

柿叶：采自山西运城地区八月新鲜柿叶,自然凉干,粉碎备用；芦丁对照品：中国药品生物制品鉴定所；95%乙醇：天津北辰方正试剂厂；其它试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 分光光度法测定柿叶中总黄酮含量

2.1.1 标准溶液的制备与测定

精密称取于105℃下烘至恒重的芦丁标准试剂10 mg，用60%（体积比）乙醇溶解，用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，得芦丁标准溶液。分别吸取标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 于 6 支 25mL 容量瓶中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，放置5 min后加入1 mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀，放置6 min后再加入10 mL1mol/LNaOH溶液，摇匀用去离子水补足至刻度，放置15 min后在510 nm处（实验测得的最大吸收波长）测定其吸光值，用空白试剂作参比。以芦丁浓度对吸光值作图，芦丁溶液在0.017 9 mg/mL～0.044 8 mg/mL范围内线性关系良好（R2=0.999 4），芦丁溶液浓度和吸光度的回归方程为：C=0.107 9A-0.000 08，式中：C为芦丁浓度，（mg/mL）；A 为吸光度。

2.1.2 提取液总黄酮含量的测定

取待测液1mL，于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min后加入1%Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，放置6 min后加入4%NaOH溶液10 mL，摇匀，用60%乙醇定容，15 min后于510 nm处测定吸光度A。将所得的吸光度带入标准曲线回归方程，可计算得提取液中总黄酮浓度[3]。

2.2 HPLC法测定柿叶中总黄酮含量

2.2.1 色谱条件的选择

色谱柱：HypersiIBDs C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）流动相：甲醇-水（体积比 50∶50）；检测波长：360 nm，流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 标准曲线的绘制

精密称取干燥恒重的芦丁标准品4.3 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，然后分别配成 0.016、0.032、0.048、0.064 mg/mL 的标准溶液于10 mL容量品中，进样测定，以进样质量浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标进行回归，得标准曲线回归方程Y=4 145.6X+3.585，芦丁溶液在0.016 mg/mL～0.064 mg/mL范围内有很好的线性关系（R2=0.999 1），式中：X为芦丁浓度，（mg/mL），Y为吸光度。

2.3 方法

2.3.1 超声波水提法

称取3 g（精确到0.001 g）经干燥、粉碎、过筛的柿叶，加入pH为11的碱水100 mL浸泡一定时间后，在一定的超声波功率下，提取一定时间后过滤，用少量乙醇洗涤滤渣，合并滤液，稀释一定倍数后按照2.1.2显色法对待测液进行含量测定，结果以每克干柿叶中所含目标成分的毫克数来表示总黄酮提取量[4]。

2.3.2 超声波溶剂提取法

准确称取2 g柿叶粉，用70%的乙醇作溶剂，按照一定配料比，确定加入乙醇的量，在一定的超声波功率下萃取一定时间，过滤后，用原提取剂定容于100 mL容量瓶中，作为待测液。按照2.1.2显色法测定浸取液吸光度值，计算提取液中总黄酮提取量。

2.3.3 微波溶剂提取法

称取一定量干燥的柿叶粉末，加入一定浓度体积量的乙醇作溶剂于锥形瓶中，在设定的微波功率下加热一定时间，取出冷却至室温，过滤，得到浸取的待测液，按照2.1.2显色法测定浸取液吸光度值，计算提取液中总黄酮提取量。

3 结果与分析

分别按照2.3.1、2.3.2、2.3.3的试验方法，通过单因素影响的考察，确定各种方法的因素水平表，然后进行正交试验，确定相应方法的最佳提取条件。

3.1 超声波水提法

3.1.1 单因素试验

3.1.1.1 提取时间对总黄酮提取量的影响

按照2.3.1方法操作，改变提取时间20min～60min，结果见图1。

图1 提取时间对提取量的影响Fig.1 The extracting time on the extraction rate of flavonoids influence

由图1可知，超声作用时间越长，提取物中黄酮含量越高。这是因为随着时间的增长，超声波对样品细胞膜的破坏程度增加。因此随着时间增加，膜破坏程度加强，溶出物增多，黄酮含量增加。随着时间进一步增加，膜被破坏，溶解的杂质进一步增加，有效成分溶解量减少，黄酮含量增加不明显[5]，故选择30 min～50 min的范围来优化提取时间。

3.1.1.2 提取温度对总黄酮提取量的影响

按照2.3.1方法操作，改变提取温度20℃～60℃，考察其对提取量的影响，结果见图2。

图2 提取温度对提取量的影响Fig.2 The extracting temperature on flavonoids extraction rate influence

由图2可知，随着超升温度的升高，总黄酮得率增大，到40℃时有最大值，再升高温度得率下降，这可能是因为黄酮类物质的结构易被高温破坏。综合考虑，选择30℃～50℃的范围来优化温度这个参数。

3.1.1.3 浸泡时间对总黄酮提取量的影响

按照2.3.1方法操作，改变物料浸泡时间5 h～48 h，考察不同浸泡时间对提取量的影响，结果见图3。

图3 浸泡时间对提取量的影响Fig.3 Soak time on flavonoids extraction rate influence

由图3可知，随着浸泡原料时间的增加，黄酮提取量不断增大，但超过6 h之后增大幅度变小，浸泡12 h后基本无变化。选择6 h～24 h范围来优化浸泡时间参数。

3.1.1.4 溶剂用量对总黄酮提取量的影响

按照2.3.1方法操作，改变溶剂量，考察其对提取量的影响，结果见图4。

由图4可知，提取量随溶剂量的增加而增大，这是因为溶剂用量越大，有效成分从植物组织内到溶液间的浓度差就越大，越有利于传质的进行，但溶剂用量达到一定程度后提取量增加缓慢[6]。根据实验结果，选取溶剂量为30 mL～90 mL范围来优化溶剂量。

3.1.2 超声水提法正交试验与结果讨论

图4 溶剂用量对提取量的影响Fig.4 Material liquid ratio on flavonoids extraction rate influence

在初步单因素的基础上，选择提取时间、温度、浸泡时间、溶剂量4个因素进行正交试验，因素水平表见表1。

表1 四因素三水平表Table 1 Four factors and three levels test table

以柿叶总黄酮提取量为考察指标，选用L9（34）对柿叶总黄酮提取工艺进行研究。正交设计及正交试验极差分析结果见表2。

表2 L9（34）正交试验设计表及极差分析结果Table 2L9（34）Results and date analysis of orthogonal design

从正交试验极差分析结果可以看出，在超声波碱水提取的条件下，各个因素对总黄酮提取量的影响大小为：溶剂量＞提取时间＞浸泡时间＞超声温度，由位级计算值K分析得最优方案是：A2B1C3D3，在此条件下进行试验，提取温度40℃，浸泡时间为6 h，提取时间为50 min，溶剂用量90 mL，所得总黄酮提取量为5.25%。而由直接观察试验结果得最优方案为A2B1C2D3，此方案下总黄酮提取量为5.28%。根据单因素试验情况，提取时间（C因素）对提取率的影响趋势如图1所示，C2（40 min）和C3（50 min）对结果带来的影响差别很小，且采用C2条件经济，同时A2B1C2D3方案提取率高，故确定最佳提取工艺条件为：A2B1C2D3。在该条件下重复3次实验，即提取温度40℃，浸泡时间为6 h，提取时间为40 min，溶剂用量90 mL，所得总黄酮平均提取率为5.281%。

3．2 超声波溶剂提取法结果[1]

按照2.3.2方法，经试验考察，选用超声波功率、萃取时间和料液比作为3因素进行正交试验，以全面研究这3个因素的交叉作用对柿叶总黄酮得率的影响。由正交试验结果及极差分析可知，各因素对黄酮得率影响的主次顺序为：A＞B＞C，即萃取时间＞超声波功率＞料液比。最后确定最佳萃取条件为：A2B3C1，即料液比为1∶20，超声波功率为220 W，萃取时间为40 min。由于最佳的萃取条件在正交试验中为出现过，所以需进行验证实验。在该最佳条件下重复3次萃取实验，得到总黄酮的平均提取量为6.19%。

3.3 微波溶剂提取法结果[5]

按照2.3.3方法，经试验考察，各因素对黄酮类化合物浸取量影响的主次顺序为B＞C＞D＞A，即：料液比＞处理时间＞乙醇浓度＞微波功率。最佳实验工艺条件为：A3B4C2D1。即微波功率为420 W，料液比为1∶25，处理时间为2 min，乙醇浓度为65%。此时，提取量为6.15%。

在最佳实验条件下，经重复实验3次，测得黄酮类化合物平均提取量为6.11%。由此可知，微波辅助法提取柿叶中黄酮类化合物重复性良好。

4 结论

和HPLC法结合，在考察单本研究采用分光光度法因素影响和正交实验时采用了分光光度法，在考察最佳工艺条件时采用HPLC法，缩短了分析时间，最终含量测定结果准确。

用超声水提法的最佳工艺条件为：超声处理时间40 min，温度40℃，溶剂量90 mL，浸泡时间为6 h，所得黄酮物质含量为5.25%；用超声溶剂提取法的最佳工艺条件为：溶剂量1∶20，超声波功率220 W，萃取时间40 min。得到总黄酮的平均提取量为6.19%；用微波溶剂提取法的最佳工艺条件为：微波功率420 W，料液比1∶25，处理时间2 min，乙醇浓度65%。提取量为6.15%。3种方法相比较，从总黄酮提取量比较，超声波溶剂法和微波溶剂法较高，比超声波水提法高出0.8%，从经济方面比较，超声波水提法虽然提取量稍低，但无需消耗大量溶剂，同时可省去溶剂回收的投资。综合两方面因素，如要进行生产投资，应采用超声波水提法更适合。

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Extraction of Flavonoids from Persimmon Leaves Process Research

WEI Jing-li，XUE Xiao-li，CHEN Yu-zhang
（Dept.ofChemistryandChemicalEngineering，TaiyuanInstitute of Technology，Taiyuan030008，Shanxi，China）

Abstract：Studied three kinds of persimmon leaf flavones extraction process and process parameters， through the orthogonal experiment， the ultrasonic water extraction， ultrasonic solvent extraction and microwave extraction method of the optimum process conditions.showed that：three methods in optimum conditions of flavonoids extraction rate were 5.28%，6.19%and 6.15%；ultrasonic water extraction method is economical and practical， suitable for the production， ultrasonic solvent extraction method and microwave solvent extraction method of extracting flavone substance is higher than water extraction，ultrasonic wave of about 0.8%higher.

Key words：Persimmon leaves；flavonoids；ultrasonic；microwave；orthogonal factoral design

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.008

山西省科技研究开发项目“从柿叶中提取黄酮化合物的研究”（编号:2007156）

卫静莉（1957—），女（汉），教授,硕士生导师，本科，研究方向：植物中有效成分提取分离纯化、化工过程与工艺等。

2012-10-21