冬虫夏草液体种子培养条件的优化

殷海松，秦韶燕，乔长晟，贾士儒

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中国）有限公司，天津 300457）

冬虫夏草液体种子培养条件的优化

殷海松1，2，秦韶燕3，乔长晟2，贾士儒2

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中国）有限公司，天津 300457）

摘 要：在摇瓶液体培养条件下，优化冬虫夏草液体种子培养条件，采用单因素和正交试验法，研究了不同培养条件对冬虫夏草液体细胞生长的影响。结果表明，在所考察的因素中，冬虫夏草液体种子最优培养条件为：培养温度24℃，转速150 r/min，装液量30%（75 mL/250 mL）。在此条件下，经摇瓶培养，获得最大菌体干重为10.45 g/L。

关键词：冬虫夏草；培养条件；正交试验；温度；转速；装液量

冬虫夏草（Cordyceps sinensis.）隶属于真菌界（Fungi）、真菌门（Eumycota）、子囊菌亚门（Ascomycotina），子囊菌纲（Ascomycetes）、肉座菌目（Hyposcreales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草属（Cordyceps spp），是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。主要分布于青海、西藏、四川、云南、甘肃、贵州等地高寒地带和雪山草原等省区[1-2]。

冬虫夏草具有补虚损，益精气，止咳化痰。治痰饮喘嗽，虚喘，痨嗽，咯血，自汗盗汗，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后久虚不复等功效，在中国从古代就被广泛用作滋补食品或补药。腺苷、虫草酸和虫草素是冬虫夏草的主要活性物质[3]。但由于过度采集，自然界中野生虫草越来越少，而且价格很高。冬虫夏草液体发酵培养，国内外均有很多研究报道，并有一系列药品和保健食品在市场上销售，而且经多年的临床使用，冬虫夏草人工菌丝制品的药理作用与天然冬虫夏草几乎一致[4]，个别有益指标高于天然冬虫夏草，但其价格要远远低于天然虫草。因此通过冬虫夏草液态发酵获得菌丝体和代谢产物非常有实际价值。

本文采用单因素和正交试验法，优化了冬虫夏草液体种子培养条件，探讨了不同培养条件对冬虫夏草细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株

冬虫夏草（Cordyceps sinensis.）：天津科技大学生物工程学院保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面种子培养基

PDA培养基。

1.2.2 液体种子培养基（g/L）

土豆200 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、KH2PO43 g/L。

1.3 仪器与设备

梅特勒FiveGo便携式pH计：瑞士梅特勒托利多；DGG型电热鼓风干燥箱：天津天宇机电有限公司；LD5-10型低速离心机：北京医用离心机厂；YHG-Ⅱ迴转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.4 测定方法

1.4.1 生物量的测定

取20 mL摇瓶培养液，离心机4 000 r/min离心20 min，除去上清夜，水洗、再离心，重复3次。收集菌丝体，60℃烘干至恒重，在干燥器中冷却到常温，称量。

1.4.2 pH的测定

用pH计测定。

2 结果与讨论

2.1 装液量对冬虫夏草细胞生长的影响

不同装液量对冬虫夏草细胞生长的影响如图1所示。

图1 不同装液量对冬虫夏草细胞生长的影响Fig.1 Effects of different medium volume in the flask on cell growth of Cordyceps sinensis

实验结果表明装液量对冬虫夏草细胞生长有较大的影响，随着装液量的增加，生物量不断增加，30%装液量时获得最大细胞干重，装液量增加到40%时，获得的菌体量下降，因此冬虫夏草摇瓶培养采用30%装液量。

2.2 培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响

不同培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响如图2所示，实验结果表明培养温度对冬虫夏草细胞生长有较大的影响，随着温度的升高，生物量不断增加，但是在24℃后继续升温，生物量反而降低，因此确定24℃为冬虫夏草最适培养温度。

2.3 转速对冬虫夏草细胞生长的影响

不同转速对冬虫夏草细胞生长的影响如图3所示。

图2 不同培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响Fig.2 Effects of different cultivation temperature on cell growth of Cordyceps sinensis

图3 不同转速对冬虫夏草细胞生长的影响Fig.3 Effect of different rotation speed on cell growth of Cordyceps sinensis

从图3中可知，随着转速的增加，生物量不断增加，在转速达到为200 r/min时获得最大的菌体干重，这是因为随着转速的增加，培养液中的溶氧增加，生物量也增加，但150 r/min和200 r/min获得细胞干重没有明显差别，主要是因为200 r/min时剪切力比较大，不利于冬虫夏草细胞的生长，另外在200 r/min获得菌丝体以大量的菌丝片段形式存在，而非菌丝球。所以综上所述，采用150 r/min为最终的转速。

2.4 正交试验设计优化冬虫夏草培养条件[5]

根据单因素试验结果，拟定影响冬虫夏草液体种子细胞生长的3个主要因素即A（培养温度），B（摇床转速）、C（装液量）为优选因素，每个因素3个水平进行L9（34）正交试验，见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平Table 1The factors and levels of the L9（34）orthogonal experiments

2.4.1 试验结果

以所得冬虫夏草细胞干重为指标，正交试验结果及极差分析和方差分析见表2和表3。

表2 L9（34）正交试验结果及极差分析Table 2The results of the L9（34）orthogonal experiments and theanalysis of range

表3 正交试验的方差分析Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiments

由正交试验结果（表2）可知，第3号试验（A1B3C3）获得的菌体干重（10.09 g/L）最大，是9次试验中最好的，因此，直接分析的最优组合为A1B3C3。

通过极差分析（表2）可知，影响冬虫夏草液体种子细胞生长各因素的主次顺序为B、A、C，因此，可以确定最优的水平组合为A2B3C2。方差分析（表3）表明：由于 F0.05

表4 验证试验结果Table 4 The results of verifying experiment

从表4中可知，当培养条件为A1B3C3、A2B3C2、A2B3C3和A2B2C2时，获得的菌体干重分别为9.74、10.19、10.56 g/L和10.45 g/L。结果表明组合A2B3C3和A2B2C2获得的菌体干重大于其它两种组合，但两者没有明显差别，另外种子培养条件是否适合，除了要看获得的菌体干重外，还要看菌丝球的形态。相对于组合A2B2C2，以A2B3C3为培养条件时，菌球在培养过程中逐渐松散，在培养后期菌丝以大量的菌丝片段形式存在，而非菌丝球，这可能是由于当转速比较高时，产生的剪切力也相应比较大，菌丝球在培养过程中被剪切成很多碎片。所以从获得的细胞干重和菌丝球形态考虑，确定冬虫夏草液体培养条件的最优组合为A2B2C2。

3 结论

通过单因素和正交试验，确定冬虫夏草液体种子最优培养条件为A2B2C2：培养温度24℃，转速150 r/min，装液量30%（75 mL/250 mL）。在此条件下，经摇瓶培养，获得最大菌体干重为10.45 g/L。

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[1]汪玲玲.冬虫夏草菌多糖发酵研究[D].广州:华南农业大学,2003

[2]毛先兵.深层培养药用蕈菌蛹虫草生产虫草素的研究[D].上海:华东理工大学,2004

[3]康廷国.中药鉴定学[M].北京:中国中医药出版社,2003:475-540

[4]王国栋.冬虫夏草及人工虫草菌丝防治肿瘤的研究概况[J].中国中医药信息杂志,1999,6(6):14-15

[5]吴贵生.试验设计与数据处理[M].北京:冶金工业出版社,1997:46-67

Optimization of Cultivation Conditions for Inoculums of Cordyceps sinensis

YIN Hai-song1，2，QIN Shao-yan3，QIAO Chang-sheng2，JIA Shi-ru2
（1.Department of Biochemical Engineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.School of Bioengineering，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；3.Reach Sugical，Inc.，Tianjin 300457，China）

Abstract：At the submerged cultivation conditions in the shake flask， to optimize the cultivation conditions for Inoculums ofCordyceps sinensis，single factor and orthogonal array design were employed for investigating the effects of different cultivation conditions on cell growth ofCordyceps sinensis.The result indicated that the optimum cultivation conditions forCordyceps sinensiswere as follows：cultivation temperature 24 ℃，rotation speed 150 r/min， the medium volume in the flask 30%（75 mL/250 mL）.At the cultivation conditions， we get 10.45 g DW/L at the submerged cultivation in the shake flask.

Key words：Cordyceps sinensis；culture conditions；orthogonal array design；temperature；；rotation speed；the medium volume in the flask

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.031

殷海松（1980—），男（汉），硕士，讲师，研究方向：发酵工程。

2013-04-09