子宫内膜癌组织中促凋亡线粒体蛋白BNIP3的表达及意义

牛菲菲，徐 红，王飞艳

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

子宫内膜癌是最常见的女性盆腔恶性肿瘤之一，为欧美国家女性生殖系统癌症发病率首位［1］，严重威胁着女性健康。研究子宫内膜癌发生进展的具体机制具有重要的临床意义。研究发现，在缺氧等条件诱导下，促凋亡线粒体蛋白(BNIP3)可诱导细胞程序性死亡。BNIP3 在肺癌［2］、胃癌［3］、结直肠癌［4］、胰腺癌［5］等多种实体肿瘤中均存在异常表达的现象，但在子宫内膜癌的相关研究甚少。2011年10月～2012年11月，我们通过qRT-PCR和免疫组化方法，观察子宫内膜癌组织中BNIP3的表达情况，探讨其在子宫内膜癌发生发展中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009年1月～2011年9月在广西医科大学第一临床附属医院手术切除的子宫内膜癌癌变内膜标本52例作为子宫内膜癌组，均经病理检查确诊为内膜样腺癌。患者年龄38～75岁、平均54岁。按照 FIGO(2000年修订版)临床分期标准，Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期21例;病理组织分级:高分化(G1)18例，中分化(G2)24例，低分化(G3)10例;有淋巴结转移14例，无淋巴结转移38例。收集同期子宫内膜不典型增生的癌前病变内膜组织14例作为不典型增生组，患者年龄38～73岁;选择因子宫肌瘤等良性病变行子宫切除术的正常子宫内膜组织36例作为对照组，患者年龄38～56岁。各组术中所得标本一分为二，一份立即液氮速冻，置于－80℃冰箱保存备用;另一份用10%甲醛液固定，石蜡包埋，连续切片，片厚约4 μm，用以行免疫组化。各组标本术前均未经放化疗及激素治疗。

1.2 主要试剂 Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，引物由上海生物工程有限公司设计并合成。BNIP3引物:上游 5'-TTCCAGCCTCGGTTTCTATTTA-3'，下游5'-GTTGGTATCTTGTGGTGTCTGC-3'，扩增产物长度137 bp;采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)做内参，GAPDH引物:上游5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'，下游 5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，扩增产物长度137 bp。BNIP3兔抗人多克隆抗体购自北京中山生物有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 BNIP3 mRNA检测 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取各组组织中的RNA，进行琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计分析，检验RNA的纯度及完整度，随后按照逆转录试剂盒的说明书及时将其逆转录成cDNA，用以进行实时定量PCR。PCR反应体系为20 μL，包括:SYBR GreenⅠ荧光染料9 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，双蒸水(ddH2O)9 μL。反应条件为95℃预变性10 min，95℃ 20 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，延伸时检测荧光信号，共40个循环。反应结束后进行熔解曲线的分析，BNIP3的基因扩增产物可见呈现单一的特异性熔解峰，曲线平稳光滑，波峰的形状较为锐利，证明产物为特异性扩增。目的基因的扩增情况以传统的相对定量法(2－ΔΔCt)进行计算分析。

1.3.2 BNIP3蛋白检测 采用免疫组化SP法。实验步骤按照试剂盒的说明进行，以自身阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。细胞核和(或)细胞质中出现棕黄或棕褐色颗粒，且染色强度明显高于背景的非特异着色为阳性表达。结果判定采用Formowitz等［6］综合计分法，每张切片均于高倍镜(×400)下选择10个具有代表性的视野，先按阳性细胞百分比打分:0分为阳性细胞百分率≤5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%;再按染色强度打分:0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。染色强度评分与阳性细胞百分率评分相加:总和＜2分为阴性，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。(+)、(++)、(+++)均视为阳性。

1.3.3 BNIP3表达水平与临床病理特征的关系记录各组患者病理分级、临床分期、有无淋巴结转移及肌层浸润等，比较各指标与BNIP3 mRNA及蛋白表达水平的相关性。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料用表示，两样本均数比较采用t检验，多组比较采用方差分析(方差不齐时采用Games-Howell法)，计数资料选用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BNIP3 mRNA表达 子宫内膜癌组、不典型增生组、对照组BNIP3 mRNA的相对表达量分别为1.64 ±0.46、1.99 ±0.59、0.82 ±0.23，不典型增生组高于对照组及子宫内膜癌组，子宫内膜癌组高于对照组(P均 ＜0.05)。

2.2 BNIP3蛋白表达 BNIP3阳性表达主要位于细胞质，部分强染色细胞的细胞核中也可见阳性表达。对照组仅见散在的细胞质阳性表达，且染色较淡;不典型增生组阳性表达以棕黄或棕褐色颗粒为主;子宫内膜癌组虽呈现弥漫性细胞质阳性表达，但以浅黄和棕黄色颗粒为主。不典型增生组BNIP3蛋白阳性率高于子宫内膜癌组及对照组，子宫内膜癌组高于对照组(P均＜0.01)。见表1。

表1 各组BNIP3蛋白表达

2.3 BNIP3 mRNA及蛋白的表达水平与临床病理特征的关系 BNIP3 mRNA及蛋白在子宫内膜癌的表达水平与病理分级、临床分期、有无淋巴结转移及肌层浸润等均无关(P＞0.05)。见表2。

3 讨论

肿瘤的形成往往是因为细胞增殖、分化的机制出现异常，凋亡通路受阻，从而表现为失控性细胞永生化。BNIP3具有调节细胞自主凋亡的能力，在多种实体瘤中均发现存在BNIP3的异常表达，因此BNIP3成为研究肿瘤发生机制的新热点，但关于其在子宫内膜癌及其癌前病变中的研究却鲜有报道。

BNIP3/NIP3基因是隶属于BcL-2家族中的BH3-only亚型，是缺氧诱导因子-1(HIF-1ɑ)的下游靶基因，正常机体内，BNIP3仅疏松地结合于线粒体外膜的胞质侧，不能发挥其促凋亡的功能，当体内凋亡信号出现时，BNIP3表达上调，胞质中的BNIP3以同源二聚体的方式与线粒体外膜紧密结合，靠其N端位于胞质侧、羧基C末端位于线粒体膜内的途径诱导线粒体通透性转运孔开放(MPTP)，线粒体功能受损，导致典型细胞凋亡坏死现象的发生［7］。

表2 BNIP3 mRNA及蛋白表达水平与子宫内膜癌临床病理特征的关系

研究发现，定位于胞质的BNIP3是正常发挥促凋亡功能的前提和保证［8］。本研究发现，子宫内膜BNIP3的表达主要定位于细胞质，且BNIP3蛋白在子宫内膜癌组(86.5%)、不典型增生组(92.9%)患者中的阳性表达率高于对照组(8.3%)。通过在胰腺癌［5］等肿瘤的研究发现，当阳性表达以胞核为主时，即使存在BNIP3的高表达，也无法发挥其诱导细胞凋亡坏死的能力，甚至会表现为凋亡逃避的反结果。因此，本实验结果可初步证实上调的BNIP3参与了正常内膜癌变的发生进展过程。

本研究采用荧光定量PCR技术，在转录水平检测了BNIP3的表达情况，结果发现子宫内膜癌组及不典型增生组BNIP3 mRNA的平均表达量均高于对照组，与免疫组化所得出的蛋白水平变化情况相符。Bruick等［9］认为，BNIP3在转录水平的上调是其蛋白表达上调的原因之一，因此BNIP3蛋白水平的上调与BNIP3 mRNA的上调相比表现相对滞后。

本研究发现，正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜及子宫内膜癌中BNIP3 mRNA及蛋白表达并非呈一种典型的渐进过程，虽然BNIP3在正常内膜明显低表达，在子宫内膜不典型增生组及子宫内膜癌组高表达，但是BNIP3在不典型增生组的表达却高于子宫内膜癌组，推测可能为BNIP3表达上调属于肿瘤发生过程中的极早期事件，即癌前病变过程中该因子的上调现象比较明显，一旦癌前病变进展为恶性肿瘤，BNIP3的表达将会因为其自身甲基化或抗凋亡因子表达增多等抑制因素的存在，使得原本表达上调的BNIP3无法继续正常发挥作用，或因被抗凋亡因子大量消耗，呈现出表达相对下调现象。但由于本研究中不典型增生内膜标本例数较少，故BNIP3表达上调在子宫内膜恶变过程中是否属于早期分子信号，能否作为早期诊断的辅助指标，对于早期诊断子宫内膜癌是否具有重大意义，仍需进一步探究。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):134.

［2］Uberall I，Kolek V，Klein J，et al.The immunohistochemical expression of BNIP3 protein in non-small-cell lung cancer:a tissue microarray study［J］.APMIS，2010，118(8):565-570.

［3］Lee SH，Jeong EG，Yoo NJ，et al.Mutational and expressional analysis of BNIP3，a pro-apoptotic Bcl-2 member，in gastric carcinomas［J］.APMIS，2007，115(11):1274-1280.

［4］Wang Z，Huang C，Zeng J，et al.Effects of the proapoptotic regulator Bcl-2/adenovirus EIB 19-kDa-interacting protein 3 on the chemosensitivity of human colon cancer cell lines［J］.Oncol Lett，2012，4(6):1195-1202.

［5］Erkan M，Kleeff J，Esposito I，et al.Loss of BNIP3 expression is a late event in pancreatic cancer contributing to chemoresistance and worsened prognosis［J］.Oncogene，2005，24(27):4421-4432.

［6］Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer［J］.Hum Pathol，1987，18(12):1268-1275.

［7］Vande Velde C，Cizeau J，Dubik D，et al.BNIP3 and genetic control of necrosis-like cell death through the mitochondrial permeability transition pore［J］.Mol Cell Biol，2000，20(15):5454-5468.

［8］Burton TR，Henson ES，Baijal P，et al.The pro-cell death Bcl-2 family member，BNIP3，is localized to the nucleus of human glial cells:implications for glioblastoma multiforme tumor cell survival under hypoxia［J］.Int J Cancer，2006，118(7):1660-1669.

［9］Bruick RK.Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(16):9082-9087.