微创血肿清除术对大鼠脑出血灶周围组织IL-6、IL-1β 表达的影响

刘振华，仉烈炜，赵佳丽，张清华，王敏忠

(1 山东大学附属省立医院，济南250021;2 山东中医药大学)

脑出血具有高致残率及致死率。研究证实，脑出血后血肿灶周存在炎性反应及炎性因子表达，是神经元继发性损害及神经功能障碍加重的原因之一［1，2］。微创血肿清除术能快速缓解血肿压迫，减轻各种炎性细胞因子对周围脑组织的损伤［3］。2010年11月～2011年3月，我们观察了不同时机微创血肿清除术对大鼠脑出血灶周围组织IL-6、IL-1β水平的影响，探讨其表达变化及对神经功能的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只，体质量260～320 g(购自山东大学医学院实验动物中心)。大鼠脑立体定向仪(STOELTNGCO.620 WHEATLANE型，美国);微量注射仪(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射器10 μL(上海高鸽工贸有限公司);ISP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及模型制备 将90只大鼠随机分为三组，分别为模型组、微创组和对照组，每组各30只。参照Rosenberg等［4］报道的方法制备模型组、微创组大鼠脑出血模型。用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，将其俯卧位固定在立体定位仪上，沿头皮正中切一长约10 mm切口，暴露前囟，于前囟前0.2 mm中线旁开3 mm处钻一直径0.5 mm的小孔，进针深度为5.5 mm，即尾壳核位置。剪尾取血，8 min内用微量进样器缓慢注入自体未抗凝动脉血50 μL，留针10 min，退针后局部用骨蜡封闭后缝合皮肤。对照组仅在尾壳核位置注射生理盐水50 μL，其余过程与其他两组相同。

1.2.2 造模成功标准 采用Bederson评分标准判断模型是否成功［5］。0分:无神经功能缺损;1分:前肢出现屈曲(即提尾悬空实验阳性);2分:一侧推抵抗力下降(即侧向推力实验阳性)，伴前肢屈曲，无转圈行为;3分:同2分行为，伴自发性旋转即提尾悬空实验阳性(自由活动时向瘫痪侧划圈)。以评分≥2分者为造模成功。

1.2.3 微创血肿清除术 微创组大鼠脑出血造模成功后4 h，重新麻醉后固定在定位仪上，微量注射器抽取尿激酶 10 μL［6］，沿钻孔处进针深 6.3 mm，缓慢注入尿激酶，5 min内注完，等待约45 min后用1 mL注射器代替微量注射器连接真空管外端，利用负压轻柔缓慢抽吸，抽吸量为总量的30%～40%，缓慢退针常规创口消毒后缝合皮肤。

1.2.4 标本采集 各组于 6、12、24、48、72 h 时分别行戊巴比妥(0.1 mL/100 g)腹腔注射，麻醉大鼠后开胸，暴露心脏及主动脉，用钝头50 mL注射器针头从左心室尖插入心室，进入主动脉，用手术剪将右心耳剪开，将37℃0.9%氯化钠溶液从50 mL注射器缓慢推入体循环，持续3～5 min，至右心耳流出的液体基本无色，将灌流液换为4%多聚甲醛磷酸缓冲液，继续灌流5 min约250 mL，断头取血肿靠近皮层侧的脑组织约2 mm×2 mm×2 mm，留大脑置于4%多聚甲醛后固定24 h以上。取出固定液中脑组织标本，常规脱水、石蜡包埋，固定脑组织。

1.2.5 脑出血灶周周组织中IL-6、IL-1β 检测 采用免疫组织化学染色。取尾状核平面切片，按常规免疫组化技术(PAP法)分别进行染色。然后在光镜下观察炎性细胞浸润等情况。IL-6、IL-1β免疫组化染色均着色于细胞质和细胞膜，免疫组化阳性细胞胞质和胞膜可见棕黄色颗粒。在紧贴血肿周围但不包括血肿区每张切片随机取4个不重复高倍视野，计算每个高倍视野下的阳性细胞数。所有切片均在同一强度下、同一放大倍数下分析，取每一时间点的高倍视野下阳性细胞数平均数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件，各组数据以表示，组间比较用t检验，多组、多时点的比较采用Post-hoc方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型组 6、12、24、48、72 h 时 IL-6、IL-1β 阳性表达细胞数高于对照组及手术组(P均＜0.05);手术组各时点IL-6、IL-1β阳性表达细胞数少于模型组(P均 ＜0.05);手术组各时点 IL-6、IL-1β 阳性表达细胞数多于对照组(P均＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点脑出血灶周组织IL-6、IL-1β 的表达(个/HP，)

表1 各组大鼠不同时间点脑出血灶周组织IL-6、IL-1β 的表达(个/HP，)

注:与对照组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，*P ＜0.05

组别 n IL-6阳性细胞数 IL-1β阳性细胞数模型组306 h 47.83 ±16.74 20.37 ±4.16△12 h 66.29 ±18.13 37.58 ±4.34△24 h 68.26 ±19.22 44.29 ±4.21△48 h 73.82 ±19.22 55.32 ±4.26△72 h 82.31 ±17.42 73.71 ±3.98△微创组 306 h 34.67 ±17.21 13.23 ±3.35*12 h 42.72 ±17.33 26.44 ±3.21*24 h 43.53 ±18.24 34.47 ±3.43*48 h 56.42 ±18.22 43.83 ±3.39*72 h 63.71 ±17.83 58.56 ±3.15*对照组 306 h 21.05 ± 7.62 11.05 ±5.3012 h 27.23 ±11.20 17.32 ±3.2024 h 32.31 ±12.22 21.61 ±4.0848 h 37.52 ±16.24 25.91 ±3.8172 h 42.20 ±11.33 24.35 ±4.28

3 讨论

脑出血后，血肿灶周围脑组织存在炎性反应，并表达多种炎性因子，可导致血肿周围脑组织神经功能缺损，进一步造成血脑屏障破坏。急性期出血灶周围脑组织表达包括IL-6及IL-1β等多种炎性细胞因子。IL-6是分子量为26 kD的细胞因子，存在于机体多种组织、血管内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞及某些肿瘤细胞中，对中枢神经系统有保护及神经毒性的双重作用［7］。正常情况下，IL-6能够促进神经修复，还可以促进神经生长及分化，抑制IL-1的合成，对神经元有保护作用。脑出血后灶周脑组织受到损伤时，胶质细胞可诱导产生IL-6。升高的IL-6可引起一系列神经损伤:IL-6刺激B细胞在肝脏合成急性反应蛋白和纤维蛋白原;抑制前列腺素I2的产生，引起血管收缩，加重脑水肿;还可增加细胞间黏附分子的表达，使白细胞与内皮细胞黏附性增强，导致微循环障碍，加重血脑屏障破坏和神经功能损害［8］。IL-1β是多形核白细胞的直接和间接趋化因子，可以通过刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子，使白细胞聚集于缺血脑组织，从而加重脑缺血损伤，是触发免疫和炎症反应的重要介质［9］。研究发现，IL-1β作为一种炎症和免疫源性细胞因子，刺激花生四烯酸的代谢，增加氧自由基的释放，诱导一氧化氮合酶生成，使一氧化氮合成、释放增加，产生神经毒性;诱导兴奋性氨基酸，启动多种细胞因子级联反应;还可刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子，使白细胞聚集在缺血组织，加重脑组织损伤［10］。

脑出血后血肿穿刺清除术的最佳治疗时机尚无定论。从手术角度多考虑为出血后4～8 d，这时血肿大部分液化，有利于清除，也不易引起再出血，但导致脑损伤程度加重，故远期疗效不佳。本研究发现，脑出血后6 h各组大鼠即可见血肿周围组织中有IL-6、IL-1β阳性的神经细胞及胶质细胞，随时间推移，表达逐渐增加增强，到72 h达到高峰，说明在脑出血早期即有脑内的炎症因子激活。在各个时间点，模型组与对照组比较，IL-6、IL-1β阳性的细胞数均增多，提示在脑出血后炎症反应起了重要作用。而微创组IL-6、IL-1β阳性细胞数表达虽多于对照组，但低于模型组，说明超早期(出血后6 h内)及时行血肿清除术，不仅解除血肿压迫引起的脑损伤，同时减轻了炎性因子继发的神经功能损害。

综上所述，脑出血后血肿灶周炎性细胞因子IL-6和IL-1β的表达增高是引起出血后神经系统损害的重要因素。超早期(出血后6 h内)进行血肿穿刺清除术可以及时解除血肿压迫，能够降低血肿灶周炎性细胞因子对脑组织的损害，保护血脑屏障，减轻脑水肿，最大限度减轻脑出血后神经功能的损伤，从而起到脑保护的作用。

［1］Samadani U，Rohde V.A review of stereotaxy and lysis for intracranial hemorrhage［J］.Neurosurg Rev，2009，32(1):15-22.

［2］Wang KW，Cho CL，Chen HJ，et al.Molecular biomarker of inflammatory response is associated with rebleeding in spontaneous intracerebral hemorrhage［J］.Eur Neurol，2011，66(6):322-327.

［3］刘振华，张清华，赵佳丽，等.血肿穿刺清除术对大鼠脑出血灶周组织中 IL-6、TNF-α 表达的影响［J］.山东医药，2012，52(34):30-31.

［4］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21(5):801-807.

［5］Bederson JB，Pitts LH，Tsu M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and delopment of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-476.

［6］Hua Y ，Keep RF，Hoff JT ，et al.Brain injury after intracerebral hemorrhage:the role of thrombin and iron［J］.Stroke，2007，38(2 suppl):759-762.

［7］Ladecola C，Acexander M.Cerebral ischemia and inflammation［J］.Currt Opin Neurol，2001，14(1):89-94.

［8］肖岚，黎杏群.白介素-6与脑缺血损伤［J］.国外医学:神经病学神经外科学分册，2000，27(5):258.

［9］Henrich-Noack P，Prenn JH，Krieglstein J，et al.Transforming growth factor beta 1 protects hippocampal neurons against degeneration caused by trainsient global ischemic:does-reponse relationship and potential neuropretective mechanisms［J］.Stroke，1996，27(9):1609-1615.

［10］Fassbender K，Rssol S，Kammer T，et al.Proinflam matory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemic kinetics of cerection and relation to the extent of brain damage and outcome disease［J］.J Neurol Sci，1994，122(2):135-139.