铁椤叶挥发油成分及生物活性研究

张大帅，王 燕，陈光英，王 菁，刘莉莉，唐 娟，尚清清，赵王丹，陈文豪

(海南师范大学“省部共建－热带药用植物化学”教育部重点实验室，化学与化工学院，海南海口571158)

铁椤(Amoora tsangii(Merr.)X.M.Chen)为楝科崖摩属(Amoora)植物，产自海南，其地上部位在民间作为蠕虫药使用［1］。有研究报道从铁椤枝叶中得到了7个新柠檬苦素类似物amotsangins A－G(1－7)，2个已知柠檬苦素类似物和4个已知倍半萜类化合物［2］，但并未见有关生物活性的研究报道。本实验利用水蒸气蒸馏法提取铁椤叶挥发油，采用GC－MS联用技术分析其的化学成分;并采用纸片琼脂扩散法和MTT比色法分别研究其抗菌、抗肿瘤活性。本文首次对铁椤叶的挥发油的化学成分和抗菌及抗肿瘤活性进行了研究，为研究铁椤叶的药用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁椤叶 2012年9月采自海南三亚，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯教授鉴定为铁椤叶，其标本保存于海南师范大学热带药用植物化学省部共建教育部重点实验室;供试菌种:金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis);肺腺癌细胞SPCA－1 南方医科大学;肝癌细胞 BEL－7402 中国科学院上海药物所;胃癌细胞 SGC－7901、白血病细胞K562 中国热带农业科学研究院;RPMI1640培养液、胰酶 Gibco公司;MTT Sigma公司;其它试剂 均为市售分析纯试剂。

7890A/5975C－GC/MSD气质联用仪 Agilent公司;Elx800酶联免疫检测仪 BioTek公司;倒置显微镜 重庆光学仪器厂;MCO－15AC CO2恒温培养箱 SANYO公司;冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂;电子天平 Sartious公司。

1.2 实验条件

［3］的方法。GC条件:石英毛细管柱HP－FFAP(30m ×0.25mm，0.25μm)，程序升温，起始温度50℃，保持1min，以5℃/min升温速率，升温到230℃保持5min，再以8℃/min升温速率，升温到280℃，然后保持至完成分析，载气为He(99.99%)，柱流量1.0mL/min，压力28.8kPa，进样口温度250℃，分流比 50∶1。

MS条件:EI源，电子能量为70eV，接口温度为280℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为180℃，溶剂延迟为2.5min，全扫描(Scan)采集模式，质量范围m/z 50～550u，扫描间隔0.50s，倍增器电压1200V。

1.3 挥发油的提取

新鲜铁椤叶总重600g，剪碎，分2次用水蒸气蒸馏法提取8h，再用无水乙醚萃取，萃取液加无水硫酸镁干燥，水浴蒸馏回收乙醚，最后得淡黄色油状物，具有浓郁的芳香味，重量为2.525g，得油率为0.42%。

1.4 体外抗菌实验

将铁椤叶挥发油配制多个浓度梯度，置冰箱(4℃)。用接种环从斜面上划取一环菌苔，溶于10mL的无菌水中，得菌悬液。将培养基倒入培养皿中，用移液器取0.2mL菌悬液注入平板涂布均匀，在已接种的平板上放入浸泡在不同浓度样品的滤纸片，用溶剂的滤纸片作为对照，以上操作均在无菌条件下进行。培养24h，观察结果。用游标卡尺采用十字交叉法测量其抑菌圈大小，然后取平均值，由抑菌圈大小比较说明抑菌作用的强弱［4］。

1.5 体外抗肿瘤实验

收集对数期细胞，配制细胞悬液，调整其细胞密度为10000个/mL，于96孔板中铺板。培养8～12h后。加入浓度梯度的挥发油(1、10、100μg/mL三个浓度)20μL，培养44h。加入MTT溶液继续培养4h。吸弃孔内培养，加入 DMSO，振荡10min，显出蓝紫色。在酶联免疫检测仪上选择570nm，用空白孔调零，测定各孔的吸光值，记录结果，计算抑制率。以浓度的对数值作横坐标，以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算。

2 结果与分析

2.1 铁椤叶挥发油分析

采用GC－MS分析铁椤叶挥发油的化学成分，应用面积归一化法分析其总离子流图(图1)得出各成分百分含量，将总离子流图通过谱数据库检索和文献资料核对，确定了其中的52个成分，结果见表1。铁椤叶挥发油的化学成分主要以倍半萜类化合物(79.15%)，(倍半萜烯化合物(59.94%)和氧化的倍半萜烯(19.21%)、醇类(5.59%)和酯类(5.17%)为主，其中含量较高的成分有石竹烯(20.58%)，(1S－顺式)－1，2，4A，5，6，8A－六氢化－4，7－二甲基－1－(甲基乙基)－萘(8.16%)，tau.－muurolol(7.32%)，橙花叔醇(6.82%)等。

图1 铁椤叶挥发油的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from the leaves of A.tsangii

2.2 铁椤叶挥发油体外抗菌结果

测定结果见表2。铁椤叶挥发油对供试菌种均有不同程度的抑制作用，且随挥发油剂量增加而增强。

表1 铁罗叶挥发油的化学成分Table 1 Chemical constituents of essential oil from the leaves of A.tsangii

续表

续表

表2 铁椤叶挥发油抑菌活性表Table 2 Antimicrobial activity of essential oil from the leaves of A.tsangii

2.3 铁椤叶挥发油抗肿瘤结果

测定结果见表3。铁椤叶挥发油对四种细胞均有一定的抑制活性;对SPCA－1和BEL－7402的抑制率大于50%。测试对这两种癌细胞的半数抑制浓度IC50。结果表明，其对SPCA－1的抑制活性最强，IC50值为11.2μg/mL;对 BEL－7402 的 IC50值为35.52μg/mL。

表3 铁椤叶挥发油对肿瘤细胞增殖的IC50值Table 3 The antitumor activity with IC50values of essential oil from the leaves of A.tsangii

3 结论

文献报道，Chiang［6］等通过 GC/MS分析铁椤同属植物A.rohituka叶和果实的挥发油，发现其叶和果均富含倍半萜类化合物，叶和果的含量分别为90.4%和87%。同时发现两部位的挥发油均表现出显著的抗菌活性。本研究发现铁椤叶的挥发油中同样是倍半萜类化合物含量较高(79.15%)。其中石竹烯(20.58%)的含量最高，该类化合物具有局部麻醉作用和治疗结肠炎作用［7］;同时可以和空气中的微粒形成容易被植物吸收的颗粒，起到净化空气的作用［8］;研究发现β－石竹烯对小鼠口服给药，能够保护胃黏膜不受乙醇强酸等致炎因子的损伤，同时不影响胃酸的分泌，而表现出很好的抗溃疡和抗炎作用［9］;从番荔枝树皮的石油醚提取物中提取到的石竹烯氧化物具有很好的镇痛和抗炎作用［10］。铁椤叶的挥发油中石竹烯(20.58%)的含量最高，推导其应有一定的抗菌活性。抗菌实验表明，铁椤叶挥发油对供试菌种(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌)均表现出不同程度的抑制作用，且呈量效关系;另外，铁椤叶挥发油对四种癌细胞(SPCA－1、BEL－7402、SGC－7901、K562)均有一定的增殖抑制活性，其中对SPCA－1 的抑制活性最强，IC50值达11.2μg/mL。

参考文献

［1］中国科学中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，2010:80－83.

［2］Chen H D，Yang S P.Limonoids and Sesquiterpenoids from Amoora tsangii［J］.J Nat Prod，2008，71(1):93－97.

［3］张大帅，钟琼芯，宋鑫明，等.簕欓花椒挥发油的GC－MS分析及抗菌抗肿瘤活性研究［J］.中药材，2012，35(8):1263－1267.

［4］Mehmet U，Emel E，Gulhan V，et al.composition，antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity of essential oil from Cinnamomum zeylanicum Blume［J］.Food Bioprod Process，2010，48(11):3274－3280.

［5］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1－2):55－63.

［6］Chiang L C，Chiang W，Chang M Y，et al.Antileukemic aetivity of Selected natural products products in Taiwan［J］.Am J Chin Med，2003，31(l):37－46.

［7］El－Sakhawy E A，Fathy F S，Megid M M，et al.Composition and antimicrobial activity of the leaf and fruit oils from Amoora rohituka Wigth.et Arn［J］.J Essent Oil Res，2000，12(5):635－638.

［8］陈旭冰，仝诚，陈光勇.β－石竹烯的研究进展［J］.山东化工，2011，40(7):34－36.

［9］Tambe Y，Tsujiuchi H，Honda G，et al.Gastric cytoprotection ofthe non － steroidalanti－ inflammatory sesquiterpene，β－caryophyllene［J］.Planta Med，1996，62(5):469－470.

［10］Chavan M J，Wakte P S，Shinde D B.Analgesic and antiinflammatory activity ofcaryophyllene oxide from Auuoua squamosa L.bark［J］.Phytomedicine，2010，17(2):149－151.