淫羊藿苷对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型超氧化物歧化酶活力的影响

李莉 李祎群 孙玉姣

(上海交通大学医学院附属仁济医院中医科，上海 200127)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征是持续存在的气流受限，气流受限呈进行性发展。氧化与抗氧化失衡是COPD的重要发病机制，该机制认为，自由基及活性氧生成过多或清除不足将导致机体氧化与抗氧化失衡［1］。淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性成分。现代药理研究［2］发现，淫羊藿苷具有抗氧化作用，对羟自由基、超氧阴离子等有较强的清除和抑制作用，可减轻自由基对机体的损伤。本研究采用烟熏联合气管内脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)滴入方法建立COPD大鼠模型，并给予淫羊藿苷处理，观察淫羊藿苷对COPD大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量(200±10)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002。

1.2 实验试剂及主要仪器 淫羊藿苷(陕西慧科植物开发有限公司);LPS(美国Sigma公司);泼尼松(上海信谊药厂有限公司);SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所);总蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 分组 50只大鼠随机分为5组，每组10只。A组为健康对照组，B组为COPD模型组，C组为淫羊藿苷治疗组，D组为泼尼松治疗组，E组为淫羊藿苷加泼尼松治疗组。A组大鼠正常饲养，不给予任何处理，B、C、D、E 组大鼠参照文献［3］建立大鼠COPD模型，于第1、17天在大鼠气管内注入 LPS 200 μg;第2～39天让大鼠在容积为100 L的密闭箱内被动吸烟，3支/次，密闭30 min，打开密闭箱透气15 min，每天重复上述过程4次。第17天不予被动吸烟。自实验第1天起，B、C、D、E组大鼠每天在被动吸烟前给予灌胃治疗:B组用蒸馏水10 mL/kg，C组用淫羊藿苷100 mg/kg，D组用泼尼松5 mg/kg，E组用淫羊藿苷50 mg/kg加泼尼松2.5 mg/kg。

1.4 标本采集 第40天用25%乌拉坦4 mL/kg麻醉大鼠，打开腹腔，从股动脉取血4 mL，室温下静置1 h，3000 r/min离心 15 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存备用。打开胸腔，分离肺组织，置于冰上，取0.1 ～0.2 g 肺组织，用冷的 0.9%氯化钠溶液洗涤以除去表面血液，滤纸拭干，称质量，与冷的0.9%氯化钠溶液按质量体积比1∶9制成10%的肺组织匀浆，2000 r/min离心10 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存备用。

1.5 SOD活力测定 用黄嘌呤氧化酶法测定外周血及肺组织匀浆中SOD的活力，具体操作按试剂盒说明。

1.6 大鼠肺组织病理形态观察 随机切取部分右肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察肺组织病理改变。

1.7 统计学处理 实验数据采用SPSS 13.0软件分析，用均数±标准差()表示。各组SOD活力比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肺组织切片的病理观察 A组肺泡结构完整，肺泡壁无炎性细胞浸润;B组肺泡壁及肺间隔炎性细胞浸润，肺间隔断裂、融合，肺实质破坏，形成广泛性肺气肿;C组肺泡壁及肺间隔内炎性细胞浸润明显，肺泡腔扩大，部分出现融合，但肺实质结构破坏程度轻;D组肺组织病理改变近似A组，肺泡壁及肺间隔少量炎性细胞浸润，少数肺泡间隔断裂、融合，形成局限性肺气肿;E组改变介于C组与D组之间，肺泡腔扩大，肺间隔断裂、融合不明显，肺组织炎性浸润明显轻于C组明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠的肺组织切片的病理结果(HE，×100)

2.2 各组大鼠肺组织匀浆和外周血中SOD活力比较 见表1。

表1 各组大鼠肺组织匀浆和外周血中SOD活力比较()

表1 各组大鼠肺组织匀浆和外周血中SOD活力比较()

注:与 A 组比较，*P ＜0.01;与 B 组比较，▲P ＜0.05

3 讨 论

吸烟是COPD的主要危险因素。香烟烟雾中的有害物质繁多，包括活性氧(ROS)、活性氮、活性醛类和醌类等等。香烟中的焦油含有醌和半醌类的自由基，能与氧快速进行氧化还原反应，生成大量的活性氧，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。这些活性氧及自由基能通过活化NF-κB信号传导途径，介导促炎性基因转录，生成大量促炎性细胞因子，诱导肺内发生炎性反应;自由基还能活化多种炎性细胞，增加气道黏液，改变体内蛋白酶/抗蛋白酶的平衡而损伤肺实质，破坏肺泡壁结构［4］。LPS是革兰阴性菌的外膜结构，是重要的致炎因子，可直接引起气道上皮损伤，导致各种炎性细胞的激活和细胞因子的释放，诱发气道炎性反应。本研究采用烟熏联合气管内LPS滴入的方法建立大鼠COPD模型。与健康对照组比较，模型组大鼠肺泡壁及肺间隔内大量炎性细胞浸润，肺间隔断裂、融合，肺泡腔融合扩大，形成肺气肿样改变，符合COPD的形态学改变，提示COPD模型造模成功。

SOD是体内重要的抗氧化剂，是人体唯一能催化超氧阴离子生成过氧化氢的酶。SOD活力的高低能反映机体清除自由基的能力。吸烟者及COPD患者体内SOD的表达及活力均较低，而SOD活力低下时可能会诱发COPD［5-6］。肺组织匀浆中SOD活力可反映局部组织对自由基的清除能力，外周血SOD活力则反映了整个机体对自由基的清除能力。

本研究发现，与A组大鼠比较，B组大鼠肺组织匀浆及外周血中SOD的活力均显著下降(P＜0.01)，提示COPD模型大鼠肺组织局部及整体均处于氧化失衡状态，SOD活力明显不足，自由基清除能力减弱，致大鼠肺组织呈肺气肿样改变。淫羊藿苷是中国传统的补益药淫羊藿的主要活性成分。其可增强细胞对超氧阴离子、羟自由基等的清除能力。本研究发现，与B组比较，C组大鼠肺组织匀浆的SOD活力下降较少(P＜0.05);外周血SOD活力呈下降趋势，但与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。C组大鼠肺泡壁及肺间隔以炎性细胞浸润为主，肺泡腔扩大，部分肺间隔断裂、融合，呈肺气肿改变，提示COPD肺组织氧化失衡严重;D组大鼠肺组织匀浆及外周血SOD活力亦显著下降，与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但大鼠只有部分肺组织的肺间隔呈现断裂、融合以及局限性肺气肿改变，程度及范围显著轻于B组，肺组织炎性细胞浸润程度显著轻于C组，提示SOD活力不足;E组大鼠肺组织形态学改变介于C组与D组之间，E组肺组织匀浆及外周血SOD活力下降与C组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，其可能的原因是:虽然淫羊藿苷应用剂量减半，对肺组织局部及整体的自由基的清除能力减弱，但联合应用的泼尼松可能产生了协同作用，这样既能减轻COPD的炎性反应，又减少了激素应用量。

综上所述，淫羊藿苷能增加SOD活力，减轻自由基对肺组织的损伤，对香烟诱导COPD的形成有一定的阻止作用。淫羊藿苷与糖皮质激素类药物具有协同作用，两者联合应用能减少激素用量。

［1］ 蔡柏蔷.慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2011年修订版)解读［J］.中华结核和呼吸杂志，2012，35(4):249-256.

［2］ Zeng KW，Fu H，Liu GX，et al.Icariin attenuates lipopolysaccharide-induced microglial activation and resultant death of neurons by inhibiting TAK1/IKK/NF-kappaB and JNK/p38 MAPK pathways［J］.Int Immunopharmacol，2010，10(6):668-678.

［3］ 宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及药物干预的影响［J］.军医进修学院学报，2001，22(2):99-102.

［4］ Rahman I.Pharmacological antioxidant strategies as therapeutic interventions for COPD ［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822(5):714-728.

［5］ Montaño M，Cisneros J，Ramírez-Venegas A，et al.Malondialdehyde and superoxide dismutase correlate with FEV(1)in patients with COPD associated with wood smoke exposure and tobacco smoking［J］.Inhalat Toxicol，2010，22(10):868-874.

［6］ Tanaka K，Sato K，Aoshiba K，et al.Superiority of PC-SOD to other anti-COPD drugs for elastase-induced emphysema and alteration in lung mechanics and respiratory function in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，302(12):L1250-1261.