lumican基因在胃癌组织中的表达及其临床意义

孔凡志 李芳 周文华 周联明 张光军 黄忠明 张学利

(1.苏州大学，江苏 苏州 215123;2.上海市奉贤区中心医院普外科，上海 201499)

近年研究［1］表明，肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展和转移的各个阶段中都起着重要的作用。lumican是肿瘤微环境中一种特殊的细胞基质蛋白，广泛存在于人体组织间质中，在黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和结直肠癌等多种肿瘤均有异常表达，但关于其在胃癌中的表达及临床特点的研究较少［2］。本研究采用免疫组化及实时荧光定量PCR等方法观察了lumican在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，并探讨了其表达水平与临床病理参数和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2004年12月—2008年1月在上海市奉贤区中心医院手术治疗并经病理确诊的胃腺癌患者144例，其中男性95例，平均年龄(63.4±27.2)岁;女性49 例，平均年龄(62.1 ±25.8)岁。根据TNM分期(UICC 1997):Ⅰ期30例，Ⅱ期49例，Ⅲ期57例，Ⅳ期8例。随访患者术后5年总生存率。切除40例胃癌患者标本后即速冻于液氮，然后置于-80℃冰箱。样本及资料收集经上海市奉贤区中心医院伦理委员会批准。

1.2 实时荧光定量PCR检测 采用Trizol试剂(日本Takara公司)抽提新鲜胃癌组织及癌旁正常黏膜组织RNA。引物序列(由上海生工生物工程公司合成):lumican上游5'-TGGAGGTCAATCAACTTGAGAA-3'，下游 5'-CAAACGCAAATGCTTGATC-TT-3';18s mRNA上游5'-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3'，下游 5'-GCATATCTTCGGCCCACA-3'。PCR 反应条件:预变性95℃ 30 s，PCR反应95℃ 5 s、60℃ 31 s，40 个循环，结束95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。通过2-Ct［Ct=Ct(lumican)– Ct(18s mRNA)］来比较lumican mRNA的相对表达水平。

1.3 免疫组化染色 标本经二甲苯脱蜡，依次梯度乙醇脱水，3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶，山羊血清封闭非特异性结合，滴加一抗lumican抗体，4℃过夜。复温后滴加二抗，室温孵育1 h后，DAB显色，苏木素复染，经梯度乙醇脱水后，用中性树脂胶封。由两位病理专家对染色结果进行评估，以lumican蛋白阳性反应颗粒定位于细胞膜和细胞质内的染色强度和染色阳性细胞的百分比确定免疫组化结果。采用染色强度和染色阳性细胞百分比双评分标准对蛋白表达进行评估，(1)依据染色强度等级评分:无色为0分，浅黄或浅褐色为1分，棕黄或褐色为2分，深褐色为3分;(2)依据染色阳性细胞百分比评分:＜25%为1分，25% ～50%为2分，50% ～75%为3分，＞75%为4分;(3)以染色强度和染色阳性细胞百分比的评分总和评分:0～1分为阴性;2～4分为弱阳性;5～7分为强阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包进行χ2检验、单因素和多因素回归分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank进行假设检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lumican蛋白在胃癌组织及癌旁正常黏膜组织的表达 lumican在胃癌组织及癌旁正常黏膜组织的间质中均可有表达，前者分布呈弥漫性或灶性，定位于细胞质或细胞膜，阳性表达构成比率为89.6%(129/144);后者阳性表达构成比率为 8.3%(12/144)，且都为弱阳性，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 lumican mRNA在胃癌组织及癌旁正常黏膜组织的表达 lumican mRNA在40例胃癌组织中表达水平较癌旁正常黏膜组织明显上调，上调约3.15倍(胃癌组织 lumican mRNA ΔCT=2.58 ±1.62，癌旁正常黏膜组织 lumican mRNA ΔCT=3.95 ±1.34)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 lumican mRNA在40例胃癌组织与癌旁正常黏膜组织的表达

2.3 lumican蛋白表达与临床各病理参数的关系lumican表达水平与患者的性别、年龄、淋巴结转移、远处转移、脉管浸润、癌栓无相关性(P＞0.05);与浸润深度(P ＜0.01)、肿瘤直径(P ＜0.01)、肿瘤部位(P＜0.05)和 UICC分期(P＜0.05)明显相关。lumican表达水平也与浸润深度显著相关，侵及深肌层组的表达水平显著高于侵及浅肌层组。肿瘤直径＞5 cm组表达水平显著高于肿瘤直径≤5 cm组，见表1。

2.4 lumican表达与术后生存率的关系 lumican强阳性、弱阳性和阴性表达组的术后5年生存率分别为86.7%、46.9% 和 30.9%。Kaplan-Meier生存统计结果显示，lumican表达在各组间的差异有统计学意义(χ2=16.927，P ＜0.01)。单因素分析表明，性别、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤直径、肿瘤部位、UICC分期、Lauren分型、脉管侵犯、癌栓和lumican表达水平是影响总体生存的因素，见表2。多因素COX模型分析显示，lumican表达水平、远处转移、肿瘤直径、UICC分期及脉管侵犯是影响总体生存的独立预后因素，见表3。lumican表达强阳性组、弱阳性组与阴性组比较，强阳性组(RR=4.972，95%CI:1.110 ～20.822)和弱阳性组(RR=5.910，95%CI:1.399 ～24.922)胃癌病死风险较高。

表1 lumican表达与胃癌临床病理参数的关系

表2 影响胃癌患者术后总体生存率的单因素回归分析

表3 影响胃癌患者术后总体生存率的多因素回归分析

3 讨 论

lumican蛋白属于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)家族［1］。氨基酸序列研究表明，lumican核心蛋白(core protein)存在4个天冬氨酸残基，能够进行N-糖基化，其糖基化水平取决于不同组织类型、发展阶段和生理条件等。目前研究［3］发现，lumican在多种恶性肿瘤细胞或肿瘤间质中有异常表达，但关于其在肿瘤发生发展中的作用有差异，如在小鼠黑色素瘤模型中其被证实可抑制肿瘤生长和进展;在骨肉瘤研究中发现其表达与细胞分化呈正相关，和骨肉瘤细胞增殖呈负相关。此外，其在胰腺癌间质中的高表达可促进胰腺癌的生长和侵袭，且患者生存期短［4］。

本研究结果显示，lumican在胃癌组织中阳性表达率为89.6%，显著高于癌旁正常黏膜组织(8.3%)，且mRNA和蛋白水平均增高，说明其表达上调发生在转录和转录后水平，提示其可能是潜在的胃癌分子诊断标记物。生存分析结果显示，lumican表达阳性的患者术后总生存率降低;COX多因素回归分析表明，lumican表达是胃癌患者术后预后不良的独立危险因素，但表达调控机制等有待进一步研究。

综上所述，lumican在胃癌组织中表达与患者的预后明确相关，其表达与肿瘤浸润深度、肿瘤直径、肿瘤部位和UICC分期密切相关，lumican高表达患者预后不良，具有一定的潜在临床意义。但其对胃癌的发生、发展与转移如何进行调控以及具体途径还有待进一步研究。

［1］ Nikitovic D，Katonis P，Tsatsakis A，et al.Lumican，a small leucinerich proteoglycan［J］.IUBMB Life，2008，60(12):818-823.

［2］ Brézillon S，Pietraszek K，Maquart FX，et al.Lumican effects in the control of tumour progression and their links with metalloproteinases and integrins［J］.FEBS J，2013，208(10):2369-2381.

［3］ Nikitovic D，Berdiaki A，Zafiropoulos A，et al.Lumican expression is positively correlated with the differentiation and negatively with the growth of human osteosarcoma cells［J］.FEBS J，2008，275(2):350-361.

［4］ Ishiwata T，Cho K，Kawahara K，et al.Role of lumican in cancer cells and adjacent stromal tissues in human pancreatic cancer［J］.Oncol Rep，2007，18(3):537-543.