湘中地区大肠杆菌自家灭活苗的研制与应用

龚泽修

（湖南娄底职业技术学院农林工程系，湖南娄底 417000）

猪大肠杆菌病是由猪源性致病性大肠杆菌感染引起的以腹泻为主的消化道传染病，临床表现主要为仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病[1]。据报道，由致病性大肠杆菌引起仔猪腹泻发病率达3 5%[2]，死亡率达11.5%～29.5%[3]，尤其是1周龄以内的新生仔猪发病率和死亡率更高，给养猪业带来了极大的经济损失。

目前很多猪场通过化学药物和菌苗接种对猪大肠杆菌病进行防治。由于长期使用大量抗菌药物，导致产生了许多耐药性菌株，对本病的治疗效果也越来越差。不同猪场的大肠杆菌血清型不同，对药物的敏感性也不一样，并导致药物治疗效果并不理想。因此，采用菌苗接种预防本病的发生十分重要。但由于大肠杆菌血清型多，各地血清型不相同[5]，对本病的预防效果差异非常大。

近年来，湘中某中型猪场持续暴发仔猪黄白痢病，用外购疫苗预防和药物治疗效果不佳，给猪场带来严重经济损失。为此，本研究从该猪场分离筛选出地方优势致病性大肠杆菌菌株制成铝胶灭活苗，经临床应用后，该猪场仔猪黄白痢得到了有效的控制。本研究为中小规模猪场大肠杆菌病进行生物防治技术研究具有十分积极的现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分离菌株

分离菌株取自湖南娄底某猪场患黄(白)痢表现严重腹泻症状的哺乳仔猪直肠中致病性大肠杆菌，用于菌苗的制造。

1.1.2 试验动物

45头妊娠母猪和458头哺乳仔猪（26日龄左右断奶），由娄底某大型养猪场提供；体重为20g左右的15只小白鼠由本校实验室提供。

1.1.3 培养基

本试验采用麦康凯琼脂培养基、普通琼脂培养基、血液琼脂培养基等，配方参照《分子克隆（第三版）》。

1.2 方法

1.2.1 菌株采集

对表现严重腹泻症状的哺乳仔猪在直肠内用灭菌棉签采集病料，接种于普通琼脂糖培养基上，37℃培养24h后，挑取表面隆起、圆形、湿润的粉红色菌落接种到血液琼脂培养基上，37℃培养24h后观察菌落形态及溶血等特征，挑取较好的菌落涂片后用革兰氏染色镜检，初步确认为大肠杆菌，再接种于胰蛋白酶黄豆琼脂斜面培养基上，37℃培养2 4 h，作为制苗用菌种。4℃冰箱保存。

1.2.2 自家灭活苗的制备

将制苗用菌种接种于肉汤培养基中，37℃振荡培养24h，在培养4h以后每间隔2h测定一次pH值，并不断调整pH至7.6，24h后按培养液的0.5%加入无菌葡萄糖液。边轻轻振荡边滴加福尔马林，使其终浓度为0.3%，37℃灭活。然后进行无菌检验，观察有无细菌生长。无任何细菌生长才是合格菌。将安全合格的菌液按10mg/mL先加入灭菌氢氧化铝胶，再加入0.1g/L的柳硫汞，充分摇匀后用已灭菌的玻璃瓶分装，即制成猪大肠杆菌自家灭活苗，可用于实验，或4℃冰箱保存。

1.2.3 自家灭活苗安全性检验

10只小白鼠作为实验组，每5只为一组，每只腹腔注射灭活苗0.2mL；5只健康小白鼠作为对照组。连续观察7d～14d，如3组小白鼠均无异常反应，则证明疫苗安全性检验合格。

1.2.4 自家灭活苗效力临床检验

选用同一饲养条件下孕期60d前未接种仔猪黄白痢菌苗的临床健康母猪45头进行预防试验，随机分为三组，每组15头，两组分别用自家灭活苗和外购大肠杆菌苗进行预防，另一组为未免疫空白对照组。自家灭活苗预防组分别于产前28d和14d肌肉注射自家灭活苗5mL，仔猪在7日龄每头腹腔注射自家灭活苗2mL；外购苗预防组同样在产前28d和14d各肌肉注射外购苗5mL，所产仔猪7日龄每头腹腔注射外购苗2mL。对照组不进行免疫接种。

2 结果

2.1 细菌形态和培养特性

从发病仔猪分离出的大肠杆菌菌株，在麦康凯琼脂培养基上生长出边缘整齐、表面光滑湿润、稍隆起、直径在1.5～2mm之间的粉红色的圆形菌落；且在营养琼脂培养基上形成表面光滑湿润、半透明的灰白色圆形菌落，证明可能是大肠杆菌。

通过分离菌株、涂片、革兰氏染色，镜检后见有粗短、两端钝圆的杆菌，其长约1～3μm，宽约0.4～0.7μm，且呈单个散开，个别成双排列。镜检中未发现芽孢和革兰氏阴性菌，符合大肠杆菌的典型形态特征。

2.2 自家灭活苗安全性检验结果

用自制的大肠杆菌灭活苗接种小白鼠，连续观察10～14d，小白鼠均无异常反应和死亡。

2.3 自家灭活苗效力的临床试验结果

通过菌苗效力临床试验观察哺乳仔猪腹泻发病率和死亡率，记录每组母猪产下的哺乳仔猪腹泻发病率和死亡率。见表1。

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从表中可知，自家灭活苗预防组仔猪腹泻发病率为5.80%，外购菌苗预防组为23.02%，对照组为46.71%，表明大肠杆菌自家灭活苗对仔猪腹泻有明显的预防效果。从死亡情况上看，自家灭活苗预防组致死率为11.11%，外购菌苗预防组致病率为17.14%、对照组致死率为21.1 3%。由此可见，使用大肠杆菌自家灭活苗可以显著降低仔猪大肠杆菌性腹泻发病率，提高仔猪成活率，显著降低治疗费用。

3 讨论

3.1 我国各地分离的致病性大肠杆菌优势血清型种类差异较大，不同养猪场的血清型差异也很大，在不同血清型之间的抗原交叉保护性较弱，用标准菌株制造的菌苗得不到预期理想的预防效果。因此，用湘中丘陵区本地猪场分离的菌株，制备相应的佐剂灭活菌苗，菌苗针对性强，安全性好，预防猪大肠杆菌病效果好。

3.2 大肠杆菌是条件性致病菌，防制该病的关键是要以预防为主，平时要加强母猪饲养管理，搞好环境卫生，提高仔猪抗病能力，定期消毒，消除各种发病诱因。 □

[1]斯特劳.猪病学(第八版)[M].北京：中国农业大学出版社，2009:445～483.

[2]王多福,魏玉明,冯国廷.仔猪大肠肝菌灭活苗的研制及效果观察[J].中国动物检疫，2000,17(5)：29～30.

[3]施启顺.猪肠毒素大肠杆菌病抗性基因及抗病育种[A].第11次全国动物遗传育种学术会议论文集（中国动物遗传育种研究进展）[M].北京：中国农业科技出版社,2001,329～333.

[4]禹滨,杨丽君,高英启,等.综合应用疫苗和抗血清防治仔猪大肠杆菌病试验[J].河北畜牧兽医,2002,18(8):17.