不同有机碳源对小球藻的生长与产油量的影响

谢林静，韩宇驰

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090)

随着化石能源的日益短缺以及燃烧化石燃料所造成的环境污染加剧，近年来生物柴油作为代替传统石油的新型能源燃料而备受关注［1］.微藻作为生物柴油原料的研究始于20 世纪60 年代［2］，近几年来该类研究得到了迅猛发展.前期研究发现，小球藻(Chlorella protothecoides)含有丰富的糖、脂类、蛋白质、叶绿素等，其细胞中的脂肪类含量约为4.5～85%［3］.因此，小球藻已经成为制备生物柴油的理想原料之一.

在小球藻的培养过程中，光照强度、温度、初始pH 值、通气量和培养基成分等都会影响小球藻的生物量累积和油脂生成.而这些因素中培养基的成分是最关键的因素之一.碳源对处于异养状态的小球藻具有较大的影响，不同的碳源对小球藻在异养时的生长状态和内部成分合成状态的影响各不相同［4，5］，对小球藻的生物量累积和油脂生成的影响也不一样.

该研究以葡萄糖和乙酸钠为碳源，对比分析两者对小球藻的生物量与产油量的影响，探讨小球藻利用有机碳源的规律.

1 材料与方法

1.1 小球藻的培养

藻株C.protothecoides 由中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库提供.小球藻的培养在250～500 mL 锥形瓶中进行，其瓶塞经过特殊处理可以用来进行被动气体交换.培养基采用的是SE(Birstrol’s solution)培养基［6］.初始pH 设定在6.8，接种量为15%，培养温度为28℃，通氧量保持在50 mL/d，摇速设定在140 rpm.在研究葡萄糖浓度对小球藻生物量与产油量的影响时，在7 个锥形瓶内分别投入30、25、20、15、10、5、和0 g/L 的葡萄糖，在如前所述的条件下同时接种并培养.在研究乙酸钠浓度的影响时，在7 个锥形瓶内分别投入24.6、20.5、16.4、12.3、8.2、4.1 和0 g/L 的乙酸钠.研究乙酸钠与葡萄糖的混合培养对小球藻的生长和油脂累积的影响时，在6 个锥形瓶内分别投入(葡萄糖/乙酸钠)0 g/20.5 g、3 g/16.4 g、6 g/12.3 g、9 g/8.2 g、12 g/4.1 g 和15 g/0 g 的混合有机碳源，并在如前所述的条件下同时接种并培养，具体的分组情况见表1.实验中的小球藻均在168 h 后采样检测.

表1 不同烧瓶编号中的葡萄糖与乙酸钠的投加比例Tab.1 The proportion of glucose and sodium acetate in different flasks

1.2 小球藻生物量的采收方法

试验中采用了离心法采收小球藻，将生长到研究需要阶段的藻液转移到离心管中，放入离心机，在转速为4 000 rpm 的条件下离心5 min，去除上清液，将下层浓缩藻泥放入冰箱中冷冻30 min 后转入冷冻干燥机中干燥24 h.取出后保存在4℃的冰箱中备用.

1.3 小球藻生物量的测定方法

取4 mL 藻液置于已称重的5 mL 离心管中，在5 000～7 000 rpm 转速下离心5 min，去上清液.并放于烘干箱中在65℃下烘干至恒重，同时测量三个平行样，取平均值.

1.4 小球藻油脂的提取方法

小球藻油脂的提取所采用的方法是正己烷与异丙醇相结合的提取方式，每4 g 干重的微藻添加300 mL 的提取液，其中正己烷和异丙醇的体积比例为3∶2.锥形瓶的瓶口用铝箔纸密封防止气体挥发，并且在800 rpm 的转速下反应8 h.细胞残留物使用Whatman GF/C 滤纸去除.滤液被转入分液漏斗并加入40 mL 水作为诱导两相稳定的引导剂.当混合溶剂分离出两个不同的层面时，上层深绿色的正己烷层包含的是被提取的油脂，下层浅绿色水醇混合层包含的是非油脂类藻细胞杂质.正己烷层的液体将被移入到一个事先称量过的容器中，并在干燥箱内以60℃的温度蒸发.蒸发使得脂肪类重量量化烘干.最终的油脂量通过重新称重获得.

2 结果与分析

2.1 葡萄糖浓度对小球藻的生长与产油的影响

葡萄糖浓度对C.protothecoides 的生物量与油脂累积的影响结果如图1 所示.由图可见，在没有葡萄糖或者微量浓度存在时，藻类的生长受到抑制，同时油脂累积量也不大.而随着葡萄糖浓度递增到15 g/L 时，含油量从10%升高到30%左右.但是随着葡萄糖浓度的进一步提高，小球藻的生物量和含油量会有所降低.由此可见，小球藻的生长和含油量的累积与葡萄糖的浓度有密切的关系.

图1 葡萄糖浓度对C.protothecoides 的生物量与油脂累积影响Fig.1 Effects of glucose concentrations on the cell growth and oil accumulation of C.protothecoides

2.2 乙酸钠浓度对小球藻的生长与产油的影响

乙酸钠作为葡萄糖之外的另一种有机物，已经被证实可以被多种细菌和植物在呼吸作用中直接被利用［7，8］.笔者以小型分子有机酸乙酸钠作为有机碳源培养C.protothecoides，研究其浓度对小球藻的生长与产油的影响，结果如图2 所示.在乙酸钠浓度为20.5 g/L 左右时，小球藻的生物量和含油量达到最大值.随着浓度的继续增加，生物量和含油量有明显的下降.由此可见，使用小分子有机酸作为碳源培养C.protothecoides 是可行的.

2.3 葡萄糖和乙酸钠对小球藻影响的对比分析

为了对比分析葡萄糖和乙酸钠在生物量累积与油脂累积中的效果，我们用生长曲线来比较分析生物量的差异(图3)，使用同当量的碳源浓度测试分析油脂累积的差异(图4).由图3 可知，在分别以葡萄糖和乙酸钠和为碳源的两组中，小球藻的生物量随着时间的增加而不断增加，在120 min 左右时，两组的生物量达到平衡.相对于葡萄糖为碳源的小球藻来说，以乙酸钠为碳源的小球藻的生物量要小一些.由图4 可知，以葡萄糖为碳源的小球藻的含油量在各种浓度条件下都高于以乙酸钠为碳源的小球藻的含油量，但两者的最高含油量相差不大.

2.4 葡萄糖和乙酸钠混合培养条件下小球藻的生长与产油情况分析

在上述单一碳源实验中，乙酸钠可以完全被小球藻利用.在这一部分，我们通过葡萄糖与乙酸钠的混合培养，分析葡萄糖和乙酸钠共存情况下的小球藻的生长和油脂累积情况，并进一步探讨葡萄糖和乙酸钠之间的区别与相互作用，实验结果如图5所示.由图可见，在混合培养期间，随着葡萄糖比例的不断提高，小球藻的生物量开始有下降的过程，此后不断上升.而含油量的多少会随着葡萄糖的含量升高而升高.单一乙酸钠为碳源时小球藻的含油量低于其他值，这说明乙酸钠在同时间内会比葡萄糖要晚被吸收利用.

图5 葡萄糖与乙酸钠的比例对小球藻生物量与油脂累积量的影响Fig.5 Effects of the proportion of glucose and sodium acetate glucose on the cell growth and oil accumulation of C.protothecoides

3 结论

葡萄糖和乙酸钠对小球藻的油脂累积的具有较大影响.乙酸钠作为碳源时，小球藻的生长量与含油量比葡萄糖作为碳源时要低.在乙酸钠与葡萄糖混合培养条件下，葡萄糖被小球藻优先吸收利用.在利用混合碳源培养时，小球藻可以实现碳源的梯级选择性利用，实现糖类和小分子挥发酸的去除.

［1］王 萌，陈章和.藻类生物柴油研究现状与展望［J］.生命科学，2011，23(1):121-126.

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